肉桂酸-4-羟化酶(C4H)测试盒
正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定
测定意义:
C4H 又称反式肉桂酸-4-单氧化酶,多存在于高等植物、酵母、菌类中,该酶催化肉桂酸羟化作用产生 4-香豆酸盐,是苯丙烷途径中继 L-苯丙氨酸解氨酶之后的第二个关键酶。
测定原理:
C4H 催化肉桂酸和 NADP 生成 4-香豆酸盐和 NADPH,在 340nm 下测定 NADPH 生成速率,即可反映 C4H 活性。
需自备的仪器和用品:
紫外分光光度计、台式离心机、可调式移液器、1mL 石英比色皿、研钵、冰和蒸馏水。
试剂的组成和配制:
提取液:100mL×1 瓶,4℃保存;
试剂一:液体 60 mL×1 瓶, 4℃保存;
试剂二:粉剂×2 瓶,-20℃保存;
粗酶液提取:
细菌或培养细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞数量(104个):提取液体积(mL)为 500~1000:1 的比例(建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液),超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率 20%或 200W,超声 3s,间隔 10s,重复 30 次);8000g 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。
组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议称取约 0.1g 组织,加入 1mL 提取液),进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。
测定步骤:
1、 分光光度计或酶标仪预热 30min 以上,调节波长至 340nm,蒸馏水调零。
2、 样本测定
(1)取试剂二一瓶,加入 25mL 试剂一充分溶解混匀,置于 37℃(哺乳动物)或 25℃(其它物种)水浴 5min;现配现用(配好后 24h 内用完);
(2)在 1mL 石英比色皿中加入 50μL 样本和 950μL 试剂二,混匀,立即记录 340nm 处初始吸光值 A1 和 5min 后的吸光值 A2,计算 ΔA=A2-A1。
C4H 活性计算:
(1)按样本蛋白浓度计算:
单位的定义:每 mg 组织蛋白每分钟产生 1 nmol 的 NADPH 定义为一个酶活力单位。
C4H(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(V 样×Cpr) ÷T=643×ΔA÷Cpr
(2)按样本鲜重计算:
单位的定义:每 g 组织每分钟产生 1 nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。
C4H(nmol/min/g 鲜重)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(W ×V 样÷V 样总) ÷T=643×ΔA÷W
(3)按细菌或细胞密度计算:
单位的定义:每 1 万个细菌或细胞每分钟产生 1 nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。
C4H(nmol/min/104cell)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(500×V 样÷V 样总) ÷T=1.286×ΔAV 反总:反应体系总体积,1×10-3L;ε:NADPH 摩尔消光系数,6.22×103L / mol /cm;d:比色皿光径,1cm;V 样:加入样本体积,0.05 mL;V 样总:加入提取液体积,1 mL;T:反应时间,5 min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;500:细菌或细胞总数,500 万。