产品咨询
组织细胞总超氧化物歧化酶SOD活性检测试剂盒（WST-8法）
产品说明：
超氧化物岐化酶(Superoxide Dismutase, SOD) 能催化超氧化物阴离子发生岐化作用，生成过氧化氢和氧气，是生物体内一种重要的抗氧化酶。在生物抗氧化机制中扮演重要角色。目前测定SOD活性常用方法有WST-1法和WST-8法，其中WST-8法比WST-1法更加稳定、灵敏度更高。本试剂盒采用了目前测定SOD方法中稳定性更好、灵敏度更高的的WST-8法。
原理：
WST-8可以和黄嘌呤氧化酶催化产生的超氧化物阴离子反应产生水溶性的甲臜染料(formazan dye)，该反应步骤可以被SOD所抑制。通过对WST-8产物的比色分析即可计算SOD酶活力。
适用范围：
实体组织、细胞中等总SOD活性。
组成：
（100次） 1. SOD检测缓冲液： 70 ml 2. WST-8： 800 ul 3. 酶溶液： 100ul 4. 反应启动液(40X): 60ul 5. 组织细胞裂解液 100ml
储存：
-20℃避光保存，6个月有效。
操作步骤：
1. 样品的准备：a.细胞样品的准备：收集细胞，用4℃或冰浴预冷的PBS 或生理盐水洗涤1-2遍。沉淀用预冷组织细胞裂解液4℃或冰浴匀浆( 可以使用玻璃匀浆器或各类常见电动匀浆器) 。随后匀浆液4℃离心，取上清作为待测样品。b.组织样品的准备：动物用生理盐水(0.9% NaCl ，含0.16mg/ml肝素钠) 灌流清除血液后获取组织样品。按照每100mg加入500-1000ul组织细胞裂解液比例， 4℃或冰浴匀浆( 可以使用玻璃匀浆器或各类常见电动匀浆器) 。随后匀浆液4 ℃离心，取上清作为待测样品。 d. 使用BCA蛋白浓度测定试剂盒（P1511）测定蛋白浓度。通常10-20ug蛋白的细胞或组织匀浆液样品中SOD平均活力约1个活力单位左右(不同细胞和组织的差异会比较大，该活力范围仅作为初步的参考) 。 每种样品准备20-100 ug蛋白量通常已经足够用于后续检测。 e. 根据蛋白浓度和预计的蛋白使用量，用试剂盒提供的SOD检测缓冲液适当稀释样品。例如，小鼠肝脏通常需要稀释10-100 倍。准备好的样品如果当天测定，可以冰浴保存；如果当天不能完成测定，可以-70 ℃冻存，但建议尽量当天完成测定。
2. 试剂盒的准备工作： a. WST-8酶工作液的配制： 参照下表，根据待检测样品(包括标准品) 数量，配制适量WST-8酶工作液，配制好的WST-8酶工作液4 ℃或冰浴保存，可当天使用，但建议尽量现配现用。 注意：由于酶溶液的用量较少且易沉降，必须注意在使用前先轻轻离心一下，然后适当混匀后再使用。
b. 反应启动工作液配制：将试剂盒提供的反应启动液 (40X) 溶解后混匀，按1μl 反应启动液(40X) 加入39μl SOD 检测缓冲液的比例进行稀释，即为反应启动工作液。4℃或冰浴保存，可当天使用，但建议尽量现配现用。
c. (可选做) SOD 标准品准备：需自备SOD标准品，用本试剂盒提供的稀释液将SOD标准品稀释至如下系列浓度：20U/ml，10U/ml ，5U/ml，2.5U/ml，1.25U/ml0.625U/ml。在随后的检测中可以各取20微升，参考样品进行检测。说明：为避免稀释后SOD酶活性的下降， SOD标准品宜现稀释现使用；本试剂盒对于SOD的检测并不需要SOD作为标准品，但可以使用SOD标准品作为阳性对照或作为对SOD活性定量的参考。
3. 样品测定： a. 参考下表使用96孔板加入各个组分，注意设置样品孔和各种空白对照孔。
注意：加入反应启动工作液后反应即会开始，可以在低温操作或用排枪操作以减小各孔间因加入反应启动工作液的时间先后差异而导致的误差。
b. 37℃孵育30分钟。 说明：孵育25至35分钟检测出来的SOD活力无显著差异，但为保证检测结果的一致性，推荐孵育30分钟。
c. 450nm 测定吸光度。如无450nm 滤光片，可以使用420-480nm 的滤光片。也可以使用大于600nm 的波长作为参考波长进行双波长测定。
4. 样品中总SOD活力的计算： a. 抑制百分率的计算： 参考如下计算公式计算抑制百分率： 抑制百分率＝[(A空白对照1－A空白对照2)－(A样品－A空白对照3)] / (A空白对照1－A空白对照2) × 100% 如果没有设置空白对照3，则可以把计算公式简化为： 抑制百分率＝(A空白对照1－A样品) / (A空白对照1－A空白对照2) × 100% 如果计算出来的抑制百分率小于30% 或大于70% ，则通常需要把该样品重新测定。尽量使样品的抑制百分率在30-70%范围内。如果测定出来的抑制百分率偏高，则需适当稀释样品；如果测定出来的抑制百分率偏低，则需重新准备浓度较高的待测样品。 b. SOD酶活力单位的定义：在上述黄嘌呤氧化酶藕联反应体系中抑制百分率为50% 时，反应体系中的SOD酶活力定义为一个酶活力单位 (unit)。注意：SOD的活力单位的定义方式有很多种，不同的活力单位需根据其定义的不同进行适当换算。 c. SOD酶活力的计算： SOD酶活力的计算公式如下： 待测样品中SOD酶活力单位＝检测体系中SOD酶活力单位＝抑制百分率/ (1－抑制百分率) units 例如，当抑制百分率为50% 时，待测样品中SOD酶活力单位＝50% / (1－50%)units＝1 unit；当抑制百分率为60% 时，待测样品中SOD酶活力单位＝60% / (1－60%)units＝1.5 units。 d.可以根据样品的蛋白浓度和稀释倍数，将SOD活力单位换算为U/g或U/mg蛋白。
说明：
1. 待测样品-70 ℃可保存1个月。需注意反复冻融会导致SOD部分失活。 2. 细胞或组织等样品制备时不能采用含有Triton X-100等去垢剂的溶液，否则会干扰本试剂盒的检测。 3. 抗氧化物会对本试剂盒的检测产生干扰，例如0.1mM ascorbic acid，5mM GSH 都会使测定出来的吸光度显著升高。此时，尽管样品没有颜色，如果设置了使用说明中的空白对照3，就可以消除样品中的抗氧化物的干扰。 4. 反应启动工作液加入后会立即有超氧化物生成，请用多通道移液器来加酶工作液以缩短时间，减少各孔间误差。 5. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。