谷胱甘肽还原酶（GR）测试盒

注意：正式测定之前选择 2-3 个预期差异大的样本做预测定。

测定意义：

GR 是广泛存在于真核和原核生物中的一种黄素蛋白氧化还原酶，是谷胱甘肽氧化还原循环的关键酶之一（通常昆虫中 GR 被 TrxR 取代）。GR 催化 NADPH 还原 GSSG 生成 GSH，有助于维持体内 GSH/GSSG 比值。GR 在氧化胁迫反应中对活性氧清除起关键作用，此外 GR还参与抗坏血酸－谷胱甘肽循环途径。

测定原理：

GR 能催化 NADPH 还原 GSSG 再生 GSH，同时 NADPH 脱氢生成 NADP+；NADPH 在 340nm 有特征吸收峰，相反 NADP+在该波长无吸收峰；通过测定 340 nm 吸光度下降速率来测定 NADPH 脱氢速率，从而计算 GR 活性。

自备仪器和用品：

低温离心机、水浴锅、移液器、紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96 孔板、和蒸馏水

试剂组成和配置：

试剂一：液体 120mL×1 瓶，4℃保存。

试剂二：粉剂×2 支，-20℃保存。临用前加入 1.2mL 蒸馏水，混匀。

试剂三：粉剂×2 支，-20℃保存。临用前加入 0.6mL 蒸馏水，混匀。

粗酶液提取：

1. 组织：按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL 试剂一）进行冰浴匀浆。8000g，4℃离心 15min，取上清，置冰上待测。

2. 细菌、真菌：按照细胞数量（104 个）：试剂一体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细胞加入 1mL 试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率 300w，超声 3 秒，间隔 7秒，总时间 3min）；然后 8000g，4℃，离心 15min，取上清置于冰上待测。

3. 血清等液体：直接测定。

操作步骤：

1. 分光光度计/酶标仪预热 30 min，调节波长到 340 nm，蒸馏水调零。

2. 试剂一置于 25℃（普通物质）或者 37℃（哺乳动物）中预热 30min。

3. 测定管：取微量石英比色皿或 96 孔板，依次加入 10μL 试剂三，20μL 试剂二，150μL 试剂一，20μL 上清液，混匀，于 340nm 迅速测定初始吸光度和 180 s 吸光度，记为 A 测 1 和A 测 2，△A 测定管= A 测 1﹣A 测 2。

(注意：

1.加完上清液后必须迅速混匀测定，保证准确测出初始反应速度；

2.当出现初始 180s 内吸光值不稳定时，可以适当延长反应时间，选取相对稳定的时间段内吸光值变化值；

3.当所测△A 测定管的值在零点附近徘徊时，可能原因：（1）样本 GR 酶活性低，建议浓缩样本后再进行测定；（2）样本 GR 酶活性过高，吸光值变化区间过小无法准确测出，建议样本稀释 2~5 倍后再进行测定)

计算公式：

a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下

(1). 按蛋白浓度计算

活性单位定义：在一定温度中，pH8.0 条件下，每毫克蛋白每分钟催化 1nmol NADPH 氧化为 1 个酶活单位。

GR 酶活(nmol/min/mg prot)= [ △A 测定管÷ε÷d×V 反总×109]÷[Cpr×V 样]÷T= 536×△A 测定管÷Cpr

(2). 按样本质量计算

活性单位定义：在一定温度中，pH8.0 条件下，每克样本每分钟催化 1nmol NADPH 氧化为1 个酶活单位。

GR 酶活(nmol/min/g 鲜重)= [ △A 测定管÷ε÷d×V 反总×109] ÷(W×V 样÷V 样总)÷T= 536×△A 测定管÷W

(3) 按细胞数量计算

活性单位定义：在一定温度中，pH8.0 条件下，每 104 个细胞每分钟催化 1nmol NADPH 氧化为 1 个酶活单位。

GR 酶活(nmol/min/104 cell)= [ △A 测定管÷ε÷d×V 反总×109] ÷(细胞数量×V 样÷V 样总)÷T= 536×△A 测定管÷细胞数量

（4）按液体体积计算

活性单位定义：在一定温度中，pH8.0 条件下，每毫升液体每分钟催化 1nmol NADPH 氧化为 1 个酶活单位。

GR 酶活(nmol/min/mL)= [ △A 测定管÷ε÷d×V 反总×109]÷×V 样÷T= 536×△A 测定管ε：NADPH 摩尔消光系数 6.22×103L/mol/cm；d：比色皿光径，1 cm；V 反总：反应体系总体积，200μL=2×10-4 L；106：1 mol=1×106μmol； Cpr：上清液蛋白浓度（mg/mL）；W ：样品质量；V 样：加入反应体系中上清液体积，20μL =2×10-2 mL；V 样总：提取液体积，1mL；V 样总：提取液体积，1 mL；T：反应时间，3 min。

b.使用 96 孔板测定的计算公式如下

(1). 按蛋白浓度计算

活性单位定义：在一定温度中，pH8.0 条件下，每毫克蛋白每分钟催化 1nmol NADPH 氧化为 1 个酶活单位。

GR 酶活(nmol/min/mg prot)= [ △A 测定管÷ε÷d×V 反总×109]÷[Cpr×V 样]÷T= 1072×△A 测定管÷Cpr

(2). 按样本质量计算

活性单位定义：在一定温度中，pH8.0 条件下，每克样本每分钟催化 1nmol NADPH 氧化为1 个酶活单位。

GR 酶活(nmol/min/g 鲜重)= [ △A 测定管÷ε÷d×V 反总×109] ÷(W×V 样÷V 样总)÷T= 1072×△A 测定管÷W

(3) 按细胞数量计算

活性单位定义：在一定温度中，pH8.0 条件下，每 104 个细胞每分钟催化 1nmol NADPH 氧化为 1 个酶活单位。

GR 酶活(nmol/min/104 cell)= [ △A 测定管÷ε÷d×V 反总×109] ÷(细胞数量×V 样÷V 样总)÷T=1072×△A 测定管÷细胞数量

（4）按液体体积计算

活性单位定义：在一定温度中，pH8.0 条件下，每毫升液体每分钟催化 1nmol NADPH 氧化为 1 个酶活单位。

GR 酶活(nmol/min/mL)= [ (△A 测定管-△A 空白管)÷ε÷d×V 反总×109]÷×V 样÷T=1072×△A 测定管ε：NADPH 摩尔消光系数 6.22×103L/mol/cm；d：96 孔板光径，0.5 cm；V 反总：反应体系总体积，200μL=2×10-4 L；106：1 mol=1×106μmol； Cpr：上清液蛋白浓度（mg/mL）；W ：样品质量；V 样：加入反应体系中上清液体积，20μL =2×10-2 mL；V 样总：提取液体积，1mL；V 样总：提取液体积，1 mL；T：反应时间，3 min。

注意事项：

（1）样品处理等过程均需要在冰上进行，且须在当日测定酶活力，匀浆液避免反复冻融；

（2）试剂二和试剂三须现配现用，配制完后，置于冰上，未使用完的 4℃保存，三天内使用完。

（3）测定前须先用 1～2 个样做预实验，哺乳动物组织一般须用试剂一稀释 2～5 倍。

（4）细胞中 GR 活性测定时，细胞数目须在 300 万-500 万之间，细胞中 GR 的提取时可加试剂一后研磨或超声波处理，不能用细胞裂解液处理细胞。