非蛋白质巯基测试盒
注意:正式测定之前选择 2-3 个预期差异大的样本做预测定。
测定意义
生物体内巯基主要包括非蛋白质巯基和蛋白质巯基。巯基化合物在体内具有重要的解毒功能,对生物体的自我调节具有非常重要的生理意义。
测定原理
巯基基团与 5,5’- 二硫代-双-硝基苯甲酸(DTNB)反应,生成黄色化合物,在 412nm 处有最大吸收峰。
自备实验用品
天平、研钵、可见分光光度计、恒温水浴锅、1mL 玻璃比色皿、乙醇和蒸馏水。
试剂组成和配制
提取液:液体 50 mL×1 瓶,4℃保存。
试剂一:液体 40 mL×1 瓶,4℃保存。
试剂二:液体 2mL×1 瓶,4℃避光保存。
样品的制备
1. 按照组织质量(g):提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议称取约 0.1g 组织,加入1mL 提取液)进行冰浴匀浆,然后 8000g,4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。
2. 血清,培养液:取 0.1mL 样本,加入 0.4mL 提取液,混匀,室温静置 10min, 然后 8000g,4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。
操作步骤
1、分光光度计预热 30min,调节波长至 412nm,双蒸水调零。
2、操作表
计算公式
非蛋白巯基标准曲线:y =3.6222 x- 0.0037,R2 = 1,x 为标品浓度,单位 μmol/mL, y 为吸光度ΔA。
1. 组织:
(1)按样本重量计算
非蛋白巯基含量(μmol/g 鲜重)=(ΔA+0.0037)÷3.6222 ×V 样总÷W=0.276×(ΔA+0.0037)÷W
(2)按样本蛋白浓度计算
非蛋白巯基含量(μmol/mg prot)=(ΔA+0.0037)÷3.6222×V 样总÷Cpr=0.276×(ΔA+0.0037)÷Cpr
2. 血清、培养液:
非蛋白巯基含量(μmol/L)=(ΔA+0.0037)÷3.6222×5 ×103=1380×(ΔA+0.0037)V 样总:加入提取液体积,1mL;W:样品质量,g ;Cpr:样本蛋白浓度,mg/mL;5:血清,培养液等液体样本稀释倍数;103 :1mmol/L=103μmol/ L
注意事项
最低检出限为 10μmol/L。