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天冬酰胺合成酶 BES-BK2593B

天冬酰胺合成酶

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 天冬酰胺合成酶

正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定

测定意义:

天冬酰胺合成酶是广泛存在于生物体内的一类氨基转移酶,催化谷氨酰胺的氨基向天冬氨酸转移。当植物处于氨毒时天冬酰胺的形成是一种解毒反应。

测定原理:

AS 催化 L-天冬酰胺水解成 L-天冬氨酸和氨,利用奈氏试剂检测氨增加的速率,即可计算其酶活性。

需自备仪器和用品:

台式离心机、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96 孔板、可调式移液枪、研钵、冰和双蒸水。

试剂组成和配制:

试剂一:液体 60mL×2 瓶,4 ℃保存;

试剂二:粉剂×2 瓶,4 ℃避光保存;临用前每瓶加入 25mL 蒸馏水充分溶解待用,现配现用;

试剂三:液体 60 mL×1 瓶,常温保存;

试剂四:液体 5 mL×1 瓶,常温保存;

试剂五:液体 3 mL×1 瓶,常温保存;

试剂六:液体3 mL×1瓶,常温避光保存。

粗酶液提取:

1、细菌、细胞或组织样品的制备:

细菌或培养细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞数量(104个):试剂一体积(mL)为 500~1000:1 的比例(建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 试剂一),超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率 20%或 200W,超声 3s,间隔 10s,重复 30 次);8000g 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。

组织:按照组织质量(g):试剂一体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议称取约 0.1g 组织,加入 1mL 试剂一),进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。

2、血清(浆)样品:直接检测。

测定步骤:

1、分光光度计或酶标仪预热 30min 以上,调节波长至 420nm,蒸馏水调零。

2、样品测定(在 EP 管中加入下列试剂):

2021091710481452371

2021091710483052763

混匀,室温静置 15min,420nm 处读取测定管和对照管吸光值,计算 ΔA=A 测定管-A 对照管。对照管只要做一管。

注意:

1、试剂六如出现沉淀,静置后取上清使用。

2、ΔA(A 测定管-A 对照管)若出现负值,可能是酶活性较低,可将反应时间 1h 延长到2h,相应的在计算公式中除以 2。

酶活性计算:

标准条件下测定的回归方程为 y = 1.9244x + 0.0057,R2 = 0.9983;x 为标准品浓度(μmol/mL),y 为吸光值 A。

1、血清(浆)AS 活性

单位定义:每 mL 血清(浆)每 min 催化谷氨酰胺生成 1nmol 氨定义为一个酶活力单位。

AS (nmol /min /mL)= (ΔA-0.0057) ÷1.9244×V 反总÷V 样÷T×1000=363.7×(ΔA -0.0057)

2、组织、细菌或细胞 AS 活性

(1)按样本蛋白浓度计算:

单位定义:每 mg 蛋白质每 min 催化谷氨酰胺生成 1nmol 氨定义为一个酶活力单位。

AS (nmol /min /mg prot)= (ΔA-0.0057) ÷1.9244×V 反总÷(V 样×Cpr)÷T×1000=363.7×(ΔA-0.0057)÷Cpr。

(2)按样本鲜重计算:

单位定义:每 g 组织每 min 催化谷氨酰胺生成 1nmol 氨定义为一个酶活力单位。

AS (nmol/min /g 鲜重)=(ΔA-0.0057)÷1.9244×V 反总÷(W×V 样÷V 样总)÷T×1000=363.7×(ΔA-0.0057)÷W。

(3)按细菌或细胞密度计算

单位定义:每 1 万个细菌或细胞每 min 催化谷氨酰胺生成 1nmol 氨定义为一个酶活力单位。

AS (nmol/min/104 cell) = (ΔA-0.0057)÷1.9244×V 反 总 ÷(500×V 样 ÷V 样 总 ) ÷T ×1000=0.7274×(ΔA -0.0057)V 样总:加入提取液体积,1 mL;T:反应时间,60min;V 反总:反应体系总体积,1.05mL;V 样:加入反应体系中样本体积,0.025mL;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;500:细菌或细胞总数,500 万; 1000,μmol 到 nmol 换算系数。


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