硝酸还原酶(NR)测试盒（NADH速率法）

正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定

测定意义

NR（ EC 1.7.1.3）广泛存在于植物中，是植物硝态氮转化为氨态氮的关键酶，也是诱导酶，对作物的产量和品质有影响。

测定原理

NR 催化硝酸盐还原为亚硝酸盐，NO3ˉ +NADH+H＋→ NO2ˉ +NAD＋+H 2 O；NADH 在 340nm 有最大吸收峰，通过测定 NADH 减少速率来表示 NR 活性。

需自备的仪器和用品

可见分光光度计、水浴锅、台式离心机、1mL 玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。

试剂的组成和配制

诱导剂储备液：液体 50mL×1 瓶，4℃保存。

提取液：液体 60mL×1 瓶，4℃保存。

试剂一：液体 20mL×1 瓶，-20℃保存。

试剂二：粉剂×2 瓶，-20℃保存；临用前每瓶加 4mL 提取液溶解，现配现用。

诱导剂应用液的配制：用时将诱导剂储备液稀释 10 倍，即取 10mL 诱导剂储备液加 90mL蒸馏水，充分混匀。

动植物组织样品的前处理：

（1）取适量诱导剂于烧杯中，将新鲜标本洗净，滤纸吸干，放入诱导剂应用液中（淹没即可），浸泡 2h，取出样本，滤纸吸干。

（2）按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入1mL 提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

注意：

1、 建议使用新鲜没有冷冻过的样本。

2、 一般不要诱导处理，预测定结果没有活性（ΔA≤0）则需要诱导处理。

细菌或培养细胞的前处理：

先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104 个）：提取液体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）；8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

测定步骤

1、分光光度计预热 30min 以上，调节波长至 340nm，蒸馏水调零。

2、样本测定

在 1mL 玻璃比色皿中依次加入 50μL 样本上清，375μL 试剂一，450μL 蒸馏水，最后加入 125μL 试剂二。充分混匀后，记录 1min 时吸光值 A1 和 6min 时吸光值 A2，ΔA=A1-A2。

NR 活性计算：

（1）按样本鲜重计算：

单位定义：每 min 每 g 鲜重样品中催化减少 1nmol NADH 的量为一个 NR 活力单位。

NR（nmol/min/g 鲜重）=ΔA÷（ε×d）×109×V 反总÷(W ×V 样÷V 样总) ÷T=643×ΔA÷W（2）按样本蛋白浓度计算：

单位定义：每 min 每 mg 组织蛋白催化减少 1nmol NADH 的量为一个 NR 活力单位。

NR（nmol/min/mg prot）=ΔA÷（ε×d）×109×V 反总÷(V 样×Cpr) ÷T=643×ΔA÷CprV 反总：反应体系总体积，1mL；ε：NADH 摩尔消光系数，6.22×103 L / mol /cm；d：比色皿光径，1cm；V 样：加入样本体积，0.05mL；V 样总：加入提取液体积，1mL；T：反应时间，5 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g