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谷氨酰胺合成酶(GS)测试盒 BES-BK2546B

谷氨酰胺合成酶(GS)测试盒

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谷氨酰胺合成酶(GS)测试盒

正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定

测定意义

GS(EC 6.3.1.2)主要存在于植物中,是生物体内氨同化的关键酶之一,催化铵离子和谷氨酸合成谷氨酰胺,不仅可以防止过多的铵离子对生物有毒性,而且谷氨酰胺也是氨的主要储存和运输形式。

测定原理

GS 在 ATP 和 Mg2+存在下,催化铵离子和谷氨酸合成谷氨酰胺;谷氨酰胺进一步转化为 γ─谷氨酰基异羟肟酸,在酸性条件下形成的络合物在 540nm 处有最大吸收峰,可用分光光度计测定。

所需的仪器和用品

可见分光光度计、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1 mL 玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。

试剂的组成和配制

提取液:30mL×1 瓶,4℃保存。

试剂一:12mL×1 瓶,-20℃保存,临用前 37℃预热 20min,充分混匀,如有沉淀,静置 10min,取上清待用。

试剂二:12mL×1 瓶,-20℃保存,临用前 37℃预热 20min,充分混匀,如有沉淀,静置 10min,取上清待用。

试剂三:粉剂×2 瓶, -20℃保存。用时每瓶加入 5mL 蒸馏水充分溶解待用。

试剂四:15mL×1 瓶,4℃保存。

样本测定的准备

1、细菌、细胞或组织样品的制备:

细菌或培养细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞数量(104个):提取液体积(mL)为 500~1000:1 的比例(建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液),超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率 20%或 200W,超声 3s,间隔 10s,重复 30 次);8000g 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。

组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议称取约 0.1g 组织,加入 1mL 提取液),进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。

2、血清(浆)样品:直接检测。

测定步骤

1、 分光光度计预热 30min 以上,调节波长至 540nm,蒸馏水调零。

2、 在 EP 管中加入下列试剂:

2021091711265468363

混匀,25℃室温静置 10min 后,5000g,25℃离心 10min,取上清液测定 540nm 处的吸光值A。△A=A 测定管-A 对照管。每个测定管需设一个对照管。

GS 活力单位的计算

标准曲线:y = 0.8348x + 0.0008,R2 = 0.9999

1、血清(浆)GS 活性

单位定义:每 mL 血清(浆)在每 mL 反应体系中每小时产生 1μmol γ-谷氨酰基异羟肟酸定义为一个酶活力单位。

计算公式:

GS(μmol/h/mL)=(ΔA-0.0008)÷0.8348×V 反总÷V 样÷T=10.268×(ΔA-0.0008)

2、组织、细菌或细胞 GS 活性

(1)按样本蛋白浓度计算:

单位的定义:每 mg 组织蛋白在每 mL 反应体系中每小时产生 1μmol γ-谷氨酰基异羟肟酸定义为一个酶活力单位。

GS(μmol/h/mg prot)=(ΔA-0.0008)÷0.8348×V 反总÷(Cpr×V 样)÷T=10.268×(ΔA-0.0008)÷Cpr

(2)按样本鲜重计算:

单位的定义:每 g 组织在每 mL 反应体系中每小时产生 1μmol γ-谷氨酰基异羟肟酸定义为一个酶活力单位。

GS(μmol/h/g 鲜重)=(ΔA-0.0008)÷0.8348×V 反总÷(W× V 样÷V 样总)÷T=10.268×(ΔA-0.0008)÷W

(3)按细菌或细胞密度计算

单位定义:每 1 万个细菌或细胞在每 mL 反应体系中每小时产生 1μmol γ-谷氨酰基异羟肟酸定义为一个酶活力单位。

GS(μmol/h/104 cell)=(ΔA-0.0008)÷0.8348×V 反总÷(500×V 样÷V 样总)÷T=0.021×(ΔA-0.0008)V 反总:反应体系总体积,0.75mL; V 样:加入样本体积,0.175mL;V 样总:加入提取液体积,1 mL;T:反应时间,30 min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;500:细菌或细胞总数,500 万。


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