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酸性磷酸酶(ACP)测试盒 BES-BK2520B

酸性磷酸酶(ACP)测试盒

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 酸性磷酸酶(ACP)测试盒

注意:正式测定之前选择 2-3 个预期差异大的样本做预测定。

测定意义:

ACP 在酸性条件下催化磷酸单酯水解称无机磷酸,常见于巨噬细胞的溶酶体内。ACP常用于前列腺癌的辅助诊断。

测定原理:

在酸性环境中,ACP 催化对硝基苯磷酸二钠水解生成 4-硝基苯酚,在 405nm 有特征光吸收;通过测定 405nm 吸光度增加速率,来计算 ACP 活性。

自备仪器和用品:

酶标仪、96 孔板、台式离心机、水浴锅、可调式移液器和蒸馏水。

试剂组成和配制:

试剂一:液体 60 mL×2 瓶,4℃保存。

试剂二:液体 50 mL×1 瓶,4℃保存。

试剂三:液体 50 mL×1 瓶,4℃保存。

粗酶液提取:

1. 组织:按照组织质量(g):试剂一体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议称取约 0.1g 组织,加入 1 mL 试剂一)进行冰浴匀浆,4℃、10000g 离心 10 min,取上清液待测。

2. 细菌或细胞:按照细菌或细胞数量(104 个):试剂一体积(mL)为 500~1000:1 的比例(建议 500 万细胞加入 1 mL 试剂一),冰浴超声波破碎细胞(功率 300w,超声 3 秒,间隔 7 秒,总时间 3 min);然后 10000g,4℃,离心 10min,取上清置于冰上待测。

3. 血液可直接测定,或者适当稀释后测定。

测定:

1. 酶标仪预热 30 min,调节波长到 405 nm。

2. 在 EP 管中加入下列试剂

2021091709504251956

混匀,吸取 200µL 加入 96 孔板中,405 nm 下测定各管吸光值。ΔA=A 测定管-A 对照管。注意:每个测定管需做一个对照管。

ACP 活性计算:

标准曲线 y = 7.3336x + 0.0179;R2 = 0.9996;x 为标准品浓度(μmol/mL),y 为吸光值ΔA。

1. 血液中 ACP 活性计算

活性单位定义:30℃中每毫升血液每分钟催化产生 1μmol 4-硝基苯酚定义为 1 个酶活单位。

ACP 活力(μmol/min/mL)=(ΔA-0.0179)÷7.3336 ×V 反总÷T÷V 样= 0.4545 ×(ΔA-0.0179)

2. 组织、细菌或细胞中 ACP 活性计算

(1)按照蛋白浓度计算

活性单位定义:30℃中每毫克蛋白每分钟催化产生 1 μmol 4-硝基苯酚定义为 1 个酶活单位。

ACP 活力(μmol/min/mg prot)= (ΔA-0.0179)÷7.3336 ×V 反总÷T÷(V 样×Cpr)=0.4545 ×(ΔA-0.0179)÷Cpr

(2)按照样本质量计算

活性单位定义:30℃中每克组织每分钟催化产生 1 μ mol 4-硝基苯酚定义为 1 个酶活单位。

ACP 活力 (μmol/min/g 鲜重)=(ΔA-0.0179)÷7.3336 ×V 反总÷T÷(W×V 样÷V 样总)= 0.4545 ×(ΔA-0.0179)÷W

(3)按照细菌或细胞数量计算

活性单位定义:30℃中每 104 个细菌或细胞每分钟催化产生 1 μ mol 4-硝基苯酚定义为 1 个酶活单位。

ACP 活力(μmol/min/104 cell)=(ΔA-0.0179)÷7.3336 ×V 反总÷T÷(细胞数量×V 样÷V 样总)= 0.4545 ×(ΔA-0.0179)÷细胞数量V 反总:反应体系总体积(mL),1 mL; W :样品质量,g; V 样:加入反应体系中样本体积(mL),0.01 mL;V 样总:提取液体积,1 mL;T:反应时间(min),30 min;500:

细胞或细菌总数,500 万。

注意事项:

ACP 不稳定,尤其在 37℃和 pH 大于 7 的条件下活力丧失快,因此酸性磷酸酶样品一般需当天准备;血清样品中,每毫升血清中加入 10mg 柠檬酸氢二钠或者 5mg 硫酸氢钠,使 pH降至 6.5 以下,或 5ml 血清加入 30%醋酸溶液 2~3 滴,置于 4℃可保存 1 周。


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