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琥珀酸脱氢酶(SDH)测试盒 BES-BK2491B

琥珀酸脱氢酶(SDH)测试盒

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琥珀酸脱氢酶(SDH)测试盒

正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定

测定意义

SDH(EC 1.3.5.1)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中。SDH 是线粒体的一种标志酶,位于线粒体内膜上的一种膜结合酶,是连接呼吸电子传递和氧化磷酸化的枢纽之一。此外,为多种原核细胞产能的呼吸链提供电子。

测定原理

SDH 催化琥珀酸脱氢生成延胡索酸,脱下的氢通过吩嗪二甲酯硫酸(PMS)传递还原 2,6-二氯酚靛酚(DCPIP),并且在 600nm 处具有特征吸收峰,通过 600nm 吸光度的变化,测定2.6-DPIP 的还原速度,代表 SDH 酶活性。

需自备的仪器和用品

可见分光光度计、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1 mL 玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。

试剂的组成和配制

试剂一:50mL×1 瓶,-20℃保存;

试剂二:10mL×1 瓶,-20℃保存;

试剂三:1mL×1 支,-20℃保存;

试剂四:液体 5mL×1 瓶,4℃保存;

试剂五:粉剂×1 支,4℃保存,临用前加入 2mL 蒸馏水,用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融;

试剂六:粉剂×1 支,-20℃避光保存;临用前加入 2mL 蒸馏水,用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融;

样本的前处理

组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离:

1、 称取约 0.1g 组织或收集 500 万细菌或细胞,加入 1mL 试剂一和 10uL 试剂三,用冰浴

匀浆器或研钵匀浆。

2、 将匀浆 600g,4℃离心 5min。

3、 弃沉淀,将上清液移至另一离心管中,11000g,4℃离心 10min。

4、 上清液即胞浆提取物,可用于测定从线粒体泄漏的 SDH(此步可选做)。在步骤④的沉淀中加入 200uL 试剂二和 2uL 试剂三,超声波破碎(冰浴,功率 20%或 200W,超声 3 秒,间隔 10 秒,重复 30 次),用于线粒体 SDH 活性测定。

测定步骤和加样表

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用蒸馏水调零后,依次加各试剂到 1 mL 玻璃比色皿中,在加入试剂六的同时开始计时,混匀,在 600 nm 波长下记录 20 秒时的初始吸光度 A1 和 1 分 20 秒时的吸光度 A2,计算ΔA=A1-A2。

SDH 活性的计算

(1) 按样本蛋白浓度计算

单位的定义:每 mg 组织蛋白每分钟消耗 1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定义为一个酶活性单位。

SDH 活性(nmol/min /mg prot)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(Cpr×V 样) ÷T=1508×ΔA÷Cpr

(2) 按样本鲜重计算

单位的定义:每 g 组织每分钟消耗 1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定义为一个酶活性单位。

SDH活性(nmol/min/g 鲜重)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(W× V样÷V样总) ÷T=304.6×ΔA÷W

(3) 按细菌或细胞密度计算

单位的定义:每1万个细菌或细胞每分钟消耗1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定义为一个酶活性单位。

SDH 活性(nmol/min /104 cell)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(500×V 样÷V 样总)÷T=0.609×ΔAV 反总:反应体系总体积,9.5×10-4 L;ε:2,6-二氯吲哚酚摩尔消光系数,2.1×104 L / mol /cm;d:比色皿光径,1cm;V 样:加入样本体积,0.03 mL;V 样总:加入提取液体积,0.202 mL;T:反应时间,1 min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;500:细菌或细胞总数,500 万。


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