柠檬酸(CA)含量测试盒
注意:正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。
测定意义:
CA是生物体内常见的有机酸,是重要的食品风味物质。此外,CA是三羧酸循环第一一步 反应的产物。
测定原理:
酸性条件下,柠檬酸还原Crt生成Cr+,在545nm处有特征吸收峰;通过测定545nm吸光值的增加,即可计算出样品中柠檬酸含量。
自备仪器和用品:
可见分光光度计、低温离心机、水浴锅、可调式移液枪、1mL玻璃比色皿和蒸馏水。
试剂组成和配制:
试剂一:液体x1瓶,4°C 保存。
试剂二:液体x1瓶,4C保存。
试剂三:液体x1支,- 20"C保存。
试剂四:粉剂x1瓶,室温保存。临用前配制,加入5mL试剂一,充分溶解。
试剂五:液体x1瓶,4'C避光保存。
标准品:液体x1 支,250umol/L 柠檬酸标准液,4'C保存。
样品处理:
1. 液体样品:取0.1mL液体加试剂一0.9mL, 充分混匀,1000g, 4C离心10min, 取上清液待测。
2.组织: 按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1: 5~10 的比例( 建议称取约0.1g组织,加入lmL试剂一)进行冰浴匀浆。11000g, 4C离心10min,取上清置冰上待测。
3.线粒体: 按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1: 5~10的比例(建议称取约0.1g组织,加入lmL试剂一)进行冰浴匀浆,600g/min, 4C离心5min;取. 上清至另一EP 管中,11000g,4'C离心10min,弃上清(此上清液可用于细胞质CA含量测定);向沉淀中加.试剂二200ul, 以及试剂三2pl,充分悬浮溶解,11000g, 4C离心10min,取. 上清液待测。
4. 细菌、真菌中:按照细胞数量(10*个): 试剂- -体积(mL)为500~1000: 1的比例(建议500万细胞加入1mL试剂一),冰浴超声波破碎细胞(功率300w,超声3秒,间隔7
秒,总时间3min); 11000g, 4'C离心10min,取上清置冰上待测。
测定操作:
1.分光光度计预热30 min,调节波长到545 nm,蒸馏水调零。
2.试剂一置于30°C水浴中预热30min。
3.空白管:取EP管,依次加入100pL蒸馏水,700uL试剂一,100uL试剂四,100uL试剂五,混匀后室温静置30min,于545nm测定吸光度,记为A空白管。
4.标准管:取EP管,依次加入100pL标准液,700μL 试剂-一, 100uL 试剂四,100μL 试剂五,混匀后室温静置30min,于545nm测定吸光度,记为A标准管。
5. 测定管:取EP管,依次加入100pL. 上清液,700uL试剂一,100uL试剂四,100uL试剂五,充分混匀后室温静置30min,于545nm测定吸光度,记为A测定管。
注意:空白管和标准管只需测定-一次。
计算公式:
1.按液体样品的体积计算
柠檬酸含量(nmol/L) = [C标准液x(A测定管一A空白管)+(A标准管一A空白管)]x样品稀释倍数xV总= 2500*(A测定管一A空白管)+(A标准管一A空白管)
C标准液: 250umol/L=0.25 m mol/L;样品稀释倍数: (0.1 mL样品+0.9mL试剂一) +0.1 mL样品=10; V总: lmL。 .
2.按组织质量计算
柠檬酸含量(nmol/g 鲜重) = [C 标准液x(A测定管- -A空白管)+(A标准管-A空白管)]xV .总+W= 250x(A测定管- -A空白管)+(A标准管一A空白管)+W
C标准液: 250μmol/L; V总:.上清液总体积, 1.0mL=0.001L; W:样品质量,g。
3.按蛋白含 量计算
柠檬酸含量(nmolmg prot)= [C标准液x(A测定管- - -A空白管)+(A标准管- A空白管)]+Cpr= 250*(A测定管- - A空白管)+(A标准管. - -A空白管)+Cpr
C标准液: 250 μ mol/L=0.25μ mol/mL; Cpr:. 上清液蛋白质 含量,mg/mL。
4.按细胞数量计算
柠檬酸含量(nmol/10* cell) = [C标准液*(A测定管- -A空白管)+(A标准管一A空白管)]xV总+细胞数量= 250*(A测定管一A空白管) +(A标准管一A空白管) +细胞数量
C标准液: 250μ mol/L; V总:上清液总体积, 1.0 mL=0.001 L;
注意事项:
1.样品处理等过程均需要在冰上进行。