过氧亚硝基阴离子（ONOO-）检测试剂盒-绿色荧光

产品简介：

过氧亚硝基阴离子（ONOO-）检测试剂盒是一种利用荧光探针O71 进行过氧亚硝基阴离子检测的试剂盒。O71 探针本身没有荧光，可以自由穿过细胞膜，进入细胞内后，在过氧亚硝基阴离子存在的条件下，O71 探针被氧化生成荧光物质 O71F，O71F 的绿色荧光强度与细胞内过氧亚硝基阴离子水平成正比，检测 O71F 绿色荧光强度就可以知道细胞内过氧亚硝基阴离子的水平。

 在激发波长 488 nm，发射波长 516 nm 附近，使用荧光酶标仪、荧光分光光度计、荧光显微镜、激光共聚焦显微镜、流式细胞仪等检测 O71F 荧光强度，从而测定细胞内过氧亚硝基阴离子水平。

 O71 荧光探针对过氧亚硝基阴离子（ONOO-）有较高的选择性，但是也会与活性羟基反应。

 本试剂盒可以用于各种真核培养细胞的检测。

产品特点：

1.使用方便：可用荧光分光光度计、荧光酶标仪或流式细胞仪检测或激光共聚焦显微镜直接拍照分析；

2.背景低，灵敏度高；

3.线性范围宽，使用方便。

使用方法：

1.螺旋盖微量试剂管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体收集至管底，避免开盖时液体洒落。

2.荧光探针标记后，一定要洗净残余的未进入细胞内的探针，否则会导致背景较高。

3.探针标记完毕并洗净残余探针后，可以进行激发波长的扫描和发射波长的扫描，以确认探针的标记情况是否正常。

4.尽量缩短探针标记后到测定所用的时间，以减少各种可能的误差。

5.对于药物作用时间较短(小于 2 小时)的细胞，可以先标记探针，后用药物刺激细胞。对于药物作用时间较长(6 小时以上)的细胞，先用相应的药物刺激细胞，后标记探针。

6.O71 染色液为 DMSO 溶液，冬季气温较低时在室温时为凝固状态，极易粘附在管壁、吸头壁。注意需要加热溶解，吸头也需要放在培养箱预热，否者容易再次凝固在吸头内壁产生损耗。

7.使用前，先将本品取出回温至室温，并对其进行简短离心使 DMSO 溶液集中于管底。

8.细胞处理需要小心操作,尽量避免人为的损伤细胞。

9.标记的条件因细胞种类而异，根据不同样本的实际染色结果做相应调整，在每次实验前，请先根据不同的实验要求、细胞类型、细胞的膜通透性等进行优化，确定最佳条件。以下方法仅供参考。

10.酚红对 O71 荧光探针的检测有干扰，需避免。

11.染色后立即进行分析。

12.以下步骤仅做为参考，稀释比例和孵育时间可根据实际情况来调整。比如，对于某些细胞，如果发现未被刺激的阴性对照细胞荧光也比较强，可降低探针浓度。如果发现用感兴趣的药物刺激后荧光较弱，可升高O71 探针浓度，以提高检测的灵敏度。另外，探针装载的时间也可以根据情况在 15-60 分钟内适当进行调整，孵育温度在 4 -37 ℃ ℃内调整。

13.必须使用荧光检测专用的黑色 96 孔板。

1. 探针染色工作液配制：

根据样本数量，用 HBSS 将 O71 荧光染料 100-500 倍稀释，配制成染色工作液。

2. 细胞探针标记

2.1 对于贴壁细胞，可以进行原位标记

1）培养皿/培养板准备细胞样本。

2）待细胞生长到合适丰度，吸除培养液，加入适量 37℃预热的含探针工作液。于生长状态下孵育 20 分钟～

30 分钟（具体孵育时间需根据细胞类型而定，需预实验优化）。

3）移除染色液，用 PBS（pH7.4）洗涤细胞 3 次。

4）荧光显微镜（含合适滤片）或流式细胞仪、荧光酶标仪下观察。最大激发/发射波长为 488 / 516 nm。

2.2 对于悬浮细胞

1）离心，吸除上清。

2）利用 37℃预热的探针工作液 100-200 μl 重悬细胞，于生长状态下孵育 20 分钟～30 分钟（具体时间需根据细胞类型而定，需预实验优化）。

3）离心，吸除染色液，加入 PBS（pH7.4）重悬细胞，洗涤 3 次。

4）流式细胞仪、荧光酶标仪检测。最大激发/发射波长为 488 / 516 nm。

3．检测：

对于原位标记探针的样品可以用荧光酶标仪检测，或者荧光显微镜，激光共聚焦显微镜直接拍照分析（需要有相关的荧光强度分析软件）。

或收集细胞后标记探针然后用荧光分光光度计、荧光酶标仪或流式细胞仪检测。

使用 488 nm 激发波长，516 nm 发射波长，实时或逐时间点检测刺激前后荧光的强弱。

过氧亚硝基阴离子浓度高则荧光强度强。

O71F 的荧光光谱和 FITC 非常相似，可以用 FITC 的参数设置进行检测。

注意事项：该产品仅供科研实验使用，未经允许不得用于其它用途！以实际收货产品说明书为准，网站说明书仅供参考。