细胞周期检测试剂盒(7-AAD)

产品简介：

细胞周期检测试剂盒是利用细胞内 DNA 能够和荧光染料结合的特性，细胞各个时期其 DNA 含量不同从而结合的荧光染料不同，流式细胞仪检测的荧光强度也不一样来检测细胞周期。

 细胞周期（cell cycle)是指细胞从前一次分裂结束起到下一次分裂结束为止的活动过程，通常由 G0/G1 期、S 期、G2 期和 M 期组成。G1 期：细胞开始 RNA 和蛋白质的合成，但 DNA含量仍保持二倍体。S 期：DNA 开始合成，这时细胞核内 DNA 的含量介于 G1 期和 G2 期之间。当 DNA 复制结束成为 4 倍体时，细胞进入 G2 期。G2 期的细胞继续合成 RNA 及蛋白质，直到进入 M 期。因此，单纯从 DNA 含量无法区分 G2 期和 M 期。一旦有丝分裂发生，细胞分裂成两个细胞，这两个细胞或者进入下一个细胞周期，或者进入静止期（G0 期），而 G0 期 从 DNA 含 量 上 同 样 无 法 与 G1 期 区 分 。 因 此 ， 整 个 复 制 周 期 可 以 描 述 为G0/G1、S、G2/M 期。通过核酸染料 PI 标记 DNA,并由流式细胞仪进行分析，可以得到细胞各个时期的分布状态，计算出 G0/G1%、S%、G2/M%，了解增殖能力，在肿瘤病理学研究中，通常以 S 期细胞比率作为判断肿瘤增殖状态的指标。 

 7AAD 为插入性核酸荧光染料，能选择性的嵌入核酸 DNA 双链螺旋的碱基之间与之结合，其结合的量与 DNA 的含量成正比例关系，用流式细胞仪进行分析，就可以得到细胞周期各个阶段的 DNA 分布状态，从而计算出各个期的百分含量。7-AAD 染色后，假设 G0/G1期细胞的荧光强度为 1，那么含有双份基因组 DNA 的 G2/M 期细胞的荧光强度的理论值为2，正在进行 DNA 复制的 S 期细胞的荧光强度为 1-2 之间。

 一般细胞周期检测试剂盒采用 PI 染色，但是由于 PI 的发射波长是<625nm,通常在 FL2 中检测,对 FITC、PE 的干扰大。PI 由于波谱较宽，同时在 FL2FL3 中也能测，所以用了 PI 最多再加一个 FITC，FL3 就没法用了。PI 还有一个重要的缺点是不容易清洗干净,使用后清洗流式细胞仪更加费时费物。

 7-AAD 细胞周期试剂盒有效的解决了这些弊端，7-AAD 的发射波长是 650nm,只占用 FL3 通道进行检测，FITC、PE 两个通道受影响都小，可以做三色分析。

产品应用：

流式细胞仪

使用方法：

1.细胞处理需要小心操作,尽量避免人为的损伤细胞。

2.最好使用含 EDTA 的细胞消化液。

3.洗涤细胞离心转速不可超过 800×g。

4.乙醇固定时离心大概采用 2000×g 力 5 分钟，离心力太小可能部分细胞难以沉淀。 

5.固定时在振荡器上轻轻振荡细胞，并缓慢滴加 75%乙醇，直接加入会导致细胞团聚的现象，很难重悬成单细胞。或者先用冷 PBS 悬浮细胞，充分悬浮，使细胞充分分散成单细胞。之后缓慢加入无水乙醇，终浓度为70-90%乙醇。乙醇固定之后须无细胞沉淀。

1. 收集样本细胞，细胞数量在 5-10X106 个。

2. 用冷 PBS 洗涤细胞两次。

3. 在 15ml 离心管中，用 500ul PBS 重悬细胞。

4. 滴加 2-5ml 冷乙醇 4℃固定过夜或-20℃固定 1 小时。

5. 取 5X106 细胞，在 15ml 锥形离心管中 1000×g 离心 10 分钟，弃上清，收集细胞。

6. 用冷 PBS 洗涤细胞两次。

7. 用 500ul 冷 PBS 重悬细胞。

8. 加入 Rnase A 溶液 20ul， 37℃水浴 30 分钟。

9. 用 400 目细胞筛网过滤。

10. 在 1000×g 离心 10 分钟，弃上清，收集细胞。

11. 用 500ul PBS 重悬细胞。

12. 加入 5ul 7-AAD 染液，充分混匀， 4℃避光孵育 30 分钟-1 小时。

13. 流式检测结果。激发波长为 488nm。发射波长 647nm。采用适当分析软件进行细胞 DNA 含量分析和光散射分析。

常见问题分析：

1.染色后找不到细胞？

固定细胞可能难以离心沉淀；固定细胞可能成团；固定细胞膜容易损伤成碎片。操作过程中注意以上几点。

2.可以不固定细胞吗？

本试剂盒可以用于非固定细胞的周期检测。

注意事项：该产品仅供科研实验使用，未经允许不得用于其它用途！以实际收货产品说明书为准，网站说明书仅供参考。