细胞周期检测试剂盒-蓝色荧光

产品简介：

细胞周期检测试剂盒是利用细胞内 DNA 能够和荧光染料结合的特性，细胞各个时期其 DNA 含量不同从而结合的荧光染料不同，流式细胞仪检测的荧光强度也不一样来检测细胞周期。

 细胞周期（cell cycle)是指细胞从前一次分裂结束起到下一次分裂结束为止的活动过程，通常由 G0/G1 期、S 期、G2 期和 M 期组成。G1 期：细胞开始 RNA 和蛋白质的合成，但 DNA含量仍保持二倍体。S 期：DNA 开始合成，这时细胞核内 DNA 的含量介于 G1 期和 G2 期之间。当 DNA 复制结束成为 4 倍体时，细胞进入 G2 期。G2 期的细胞继续合成 RNA 及蛋白质，直到进入 M 期。因此，单纯从 DNA 含量无法区分 G2 期和 M 期。一旦有丝分裂发生，细胞分裂成两个细胞，这两个细胞或者进入下一个细胞周期，或者进入静止期（G0 期），而 G0 期 从 DNA 含 量 上 同 样 无 法 与 G1 期 区 分 。 因 此 ， 整 个 复 制 周 期 可 以 描 述 为G0/G1、S、G2/M 期。通过核酸染料 PI 标记 DNA,并由流式细胞仪进行分析，可以得到细胞各个时期的分布状态，计算出 G0/G1%、S%、G2/M%，了解增殖能力，在肿瘤病理学研究中，通常以 S 期细胞比率作为判断肿瘤增殖状态的指标。 

 DAPI 为插入性核酸荧光染料，能选择性的嵌入核酸 DNA 双链螺旋的碱基之间与之结合，其结合的量与 DNA 的含量成正比例关系，用流式细胞仪进行分析，就可以得到细胞周期各个阶段的 DNA 分布状态，从而计算出各个期的百分含量。DAPI 染色后，假设 G0/G1 期细胞的荧光强度为 1，那么含有双份基因组 DNA 的 G2/M 期细胞的荧光强度的理论值为 2，正在进行 DNA 复制的 S 期细胞的荧光强度为 1-2 之间。

 DAPI 探针的最大激发波长为 358 nm，最大发色波长为 461 nm。

 除了本试剂盒提供的蓝色荧光细胞周期检测产品，还能提供绿色、红色、橙色、深红色等荧光颜色的细胞周期检测试剂盒产品。

 可以提供各种细胞分析试剂盒。包括细胞凋亡、活性、增殖、毒性、活性氧、周期、细胞代谢、氧化应激、膜流动性、膜电位、膜通透性转换孔、细胞耗氧率、胞外酸化、细胞内 pH、细胞粘附、细胞自噬等数百种细胞检测试剂盒产品。

 可以为您提供各种细胞成像、细胞示踪与追踪试剂盒产品。包括各种颜色的系列、N 系列、L 系列、E 系列、G 系列等细胞膜、细胞质、细胞核、溶酶体、线粒体、内质网、高尔基体、骨架、微管等细胞、细胞亚结构荧光染色试剂盒产品，以及钙离子、钠离子、氩离子等各种荧光染色试剂盒产品。

 可以提供动物、植物、微生物、酵母、水产、家禽、兽类、土壤等样本的各种生化指标检测的数百种试剂盒产品。

 可以提供各种细胞、组织染色，免疫组织化学，细胞培养等相关试剂盒产品。

产品应用：

流式细胞仪

使用方法：

1.细胞处理需要小心操作,尽量避免人为的损伤细胞。

2.最好使用含 EDTA 的细胞消化液。

3.洗涤细胞离心转速不可超过 800×g。

4.乙醇固定时离心大概采用 2000×g 力 5 分钟，离心力太小可能部分细胞难以沉淀。

5.固定时在振荡器上轻轻振荡细胞，并缓慢滴加 75%乙醇，直接加入会导致细胞团聚的现象，很难重悬成单细胞。或者先用冷 PBS 悬浮细胞，充分悬浮，使细胞充分分散成单细胞。之后缓慢加入无水乙醇，终浓度为70-90%乙醇。乙醇固定之后须无细胞沉淀。

6.为防止不同批次细胞在实验时本身所出周期不同导致重复性差，可以在实验前进行细胞的同步化处理，减少批间差异。实验细胞应处于对数生长期，不能是完全长满，一般在 50～80％比较好。

7.分析的时候需要的是单个的细胞，400 目筛网过滤是用来将粘在一起的细胞团滤掉，否则会出现人为的多倍体干扰，不过如果经验丰富的操作人员也可以 gate 掉。如果没有条件过滤，请在染色之前将细胞弹的很散，再进行染色。

8.本试剂盒也可用于非固定细胞周期检测。

9.组织处理方法：用剪刀将组织剪成小块，用 0.25%胰酶消化 30min－1h，200－400 目筛网过滤细胞，获得

单细胞悬液。如组织难以消化，可加入适量胶原酶。

1. 每 100 μl PBS 或 HBSS 缓冲液中加入 10 μl DAPI 染液，充分混匀，配制成染色工作液。

2. 收集样本细胞，细胞数量在 5-10X106 个。

【注】：

用 300-800×g 力离心 5 分钟。

不同细胞离心力不同，以实验室常用离心力为准。

3. 用冷 PBS 洗涤细胞两次。

【注】：

在 300-800×g 左右，离心 5 分钟，小心吸取上清，避免吸走细胞。

4. 在 15 ml 离心管中，用 500 μl PBS 重悬细胞。

【注】：

此时要保证是好的单个细胞悬浮液。否则细胞会被成团固定。

5. 滴加 2-5 ml 冷乙醇 4℃固定过夜或-20℃固定 1 小时。

【注】：

要非常慢的加乙醇，并轻微振荡防止细胞成团。

轻轻吹打混匀，避免细胞成团；不能太剧烈，防止细胞损伤成碎片。

到此步可以存放，-20℃保存样品，1 周内样品检测不受影响。

最长可以存放 3 周。

6. 取 5X106 细胞，在 15 ml 锥形离心管中 1000×g 离心 10 分钟，弃上清，收集细胞。

7. 用冷 PBS 洗涤细胞两次。

【注】：

乙醇固定的细胞难以沉淀。可以在 PBS 中添加 1%的 BSA 或小牛血清改善。

或者稍微加大离心力。

8. 用 500 μl 冷 PBS 重悬细胞。

【注】：

可以用添加 1%的 BSA 或小牛血清的 PBS 重悬。

9. 加入 Rnase A 溶液 20 μl， 37℃水浴 30 分钟。

10. 用 400 目细胞筛网过滤。

【注】：

无细胞筛网可以不做此步骤。

11. 在 1000×g 离心 10 分钟，弃上清，收集细胞。

12. 加入 100 μl DAPI 染色工作液重悬细胞，轻轻混匀后 4℃避光孵育 30 分钟-1 小时。

【注】：

染色完成后宜在 24h 内完成流式检测。

13. 加入 400 μl PBS 或 HBSS 缓冲液混匀。

14. 流式检测结果。激发波长为 358 nm。发射波长 461 nm。采用适当分析软件进行细胞 DNA 含量分析和光散射分析。

常见问题分析：

1.染色后找不到细胞？

固定细胞可能难以离心沉淀；固定细胞可能成团；固定细胞膜容易损伤成碎片。操作过程中注意以上几点。

2.可以不固定细胞吗？

本试剂盒可以用于非固定细胞的周期检测。

注意事项：该产品仅供科研实验使用，未经允许不得用于其它用途！以实际收货产品说明书为准，网站说明书仅供参考。