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3-磷酸甘油酸激酶(PGK)测试盒 BES-BK2459B

3-磷酸甘油酸激酶(PGK)测试盒

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3-磷酸甘油酸激酶(PGK)测试盒

注意:正式测定之前选择 2-3 个预期差异大的样本做预测定。

测定意义

3-磷酸甘油酸激酶是糖酵解的关键酶,广泛存在于动植物和微生物体内,催化 1,3-二磷酸甘油酸转变为 3-磷酸甘油酸,产生 1 分子 ATP,具有影响 DNA 复制和修补及刺激病毒 RNA合成等生物学功能,广泛应用于药物靶标设计。

 测定原理

3-磷酸甘油酸激酶催化 3-磷酸甘油酸和 ATP 产生 1,3-二磷酸甘油酸和 ADP,1,3-二磷酸甘油酸在 3-磷酸甘油醛脱氢酶和 NADH 作用下产生 3-磷酸甘油醛、NAD 和磷酸,340nm 处的吸光度变化反映了 3-磷酸甘油酸激酶的活性的高低。 

自备实验用品及仪器

天平、低温离心机、研钵、紫外分光光度计、1 mL 石英比色皿。

 试剂组成和配制

提取液:液体 100mL×1 瓶,4℃保存。

试剂一:液体 25mL×1 瓶,4℃避光保存。

试剂二:粉剂×1 瓶,-20℃避光保存。临用前加 5mL 蒸馏水充分溶解;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融。

试剂三:粉剂×1 瓶,-20℃避光保存。临用前加 2.5 mL 蒸馏水充分溶解;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融。

试剂四:粉剂×1 瓶,-20℃避光保存。临用前加 2.5 mL 蒸馏水充分溶解;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融。

试剂五:粉剂×1 瓶,-20℃避光保存。临用前加 10 mL 蒸馏水充分溶解;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融。 酶液提取

①总 PGK 酶提取:建议称取约 0.1g 样本,加入 1mL 提取液,冰浴匀浆后超声破碎(冰浴,200W,破碎 3s,间歇 7s,总时间 1min),然后 4℃,500g 离心 5min,取上清测定。

②胞浆和叶绿体 PGK 酶的分离:按照植物组织质量(g):提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议称取约 0.1g 样本,加入 1mL 提取液),冰浴匀浆后于 4℃,500g 离心 5min,弃沉淀,取上清在 4℃,8000g 离心 10min,取上清用于测定胞浆 PGK 酶活性,取沉淀加 1mL提取液,震荡溶解后超声破碎(冰浴,200W,破碎 3s,间歇 7s,总时间 1min),然后 4℃,500g 离心 5min,取上清测定叶绿体中 PGK 酶活性。

建议测定总 PGK 酶活性,按照步骤①提取粗酶液,若需要分别测定胞浆和叶绿体中的 PGK,则按照步骤②提取粗酶液。

 测定操作

1. 分光光度计预热 30min,调节波长至 340nm,蒸馏水调零。

2. 取 1mL 石英比色皿,依次加入 500μL 试剂一,100μL 试剂二,50μL 试剂三,50μL 试剂四,200μL 试剂五,100μL 粗酶液,充分混匀,记录 340nm 处 10s 的吸光值 A1 和 310s的吸光值 A2,△A=A1-A2

计算公式

(1)按照样本蛋白浓度计算

酶活单位定义:每毫克组织蛋白每分钟消耗 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。

PGK(nmol/min /mg prot)=ΔA÷(ε×d)×V 反总÷(V 样×Cpr) ÷T=321.54×ΔA÷Cpr

(2)按照样本质量计算

酶活单位定义:每克组织每分钟消耗 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。

PGK(nmol/min /g 鲜重)=ΔA÷(ε×d)×V 反总÷(W ×V 样÷V 样总) ÷T=321.54×ΔA÷WV 反总:反应体系总体积,1mL;ε:NADH 摩尔消光系数,6.22×10

3 L / mol /cm;d:比色皿光径,1cm;V 样:加入样本体积,0.1mL;V 样总:加入提取液体积,1mL;T:反应时间,5 min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g


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