磷酸丙糖异构酶(TPI)测试盒
注意:正式测定之前选择 2-3 个预期差异大的样本做预测定。
测定意义
植物叶绿体中磷酸丙糖异构酶是光合作用中参与 calvin 循环的重要酶。作用于磷酸甘油醛和磷酸二羟丙酮之间的转化,磷酸二羟丙酮能快速透过叶绿体的包膜进入细胞质,并在其中逐步转化为蔗糖。
测定原理
磷酸丙糖异构酶将磷酸二羟丙酮转化为 3-磷酸甘油醛,3-磷酸甘油醛与 NAD 在 3-磷酸甘油醛脱氢酶的作用下生成 3-磷酸甘油酸和 NADH,340nm 处的吸光度变化反映了磷酸丙糖异构酶的活性的高低。
自备实验用品及仪器
天平、低温离心机、研钵、震荡仪、紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96 孔板。
试剂组成和配制
提取液一:液体 100mL×1 瓶,4℃保存。
提取液二:液体 100mL×1 瓶,4℃保存。
试剂一:液体 12mL×1 瓶,4℃保存。
试剂二:粉剂×1 瓶,-20℃避光保存。临用前加 2mL 蒸馏水充分溶解;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融。
试剂三:粉剂×1 瓶,-20℃避光保存。临用前加 2 mL 蒸馏水充分溶解;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融。
试剂四:粉剂×1 瓶,-20℃避光保存。临用前加 2 mL 蒸馏水充分溶解;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融。
酶液提取
①总 TPI 酶提取:建议称取约 0.1g 样本,加入 1mL 提取液一,冰浴匀浆后超声破碎(冰浴,200W,破碎 3s,间歇 7s,总时间 1min),然后 4℃,8000g 离心 10min,取上清测定。
②胞浆和叶绿体 TPI 酶的分离:按照植物组织质量(g):提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议称取约 0.1g 样本,加入 1mL 提取液一),冰浴匀浆后于 4℃,200g 离心 5min,弃沉淀,取上清在 4℃,8000g 离心 10min,取上清用于测定胞浆 TPI 酶活性,取沉淀加 1mL提取液二,震荡溶解后超声破碎(冰浴,200W,破碎 3s,间歇 7s,总时间 1min),然后 4℃,8000g 离心 10min,取上清测定叶绿体中 TPI 酶活性。
建议测定总 TPI 酶活性,按照步骤①提取粗酶液,若需要分别测定胞浆和叶绿体中的 TPI,则按照步骤②提取粗酶液。
测定操作
1. 分光光度计/酶标仪预热 30min,调节波长至 340nm,蒸馏水调零。
2. 取微量石英比色皿/96 孔板,依次加入 120μL 试剂一,20μL 试剂二,20μL 试剂三,20μL试剂四,20μL 粗酶液,充分混匀,记录 340nm 处 10s 的吸光值 A1 和 310s 的吸光值 A2,△A=A2-A1
计算公式
a. 用微量石英比色皿测定的计算公式如下
(1)按照样本蛋白浓度计算
酶活单位定义:每毫克组织蛋白每分钟生成 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。
TPI(nmol/min/mg prot)= ΔA÷(ε×d)×V 反总÷(V 样×Cpr) ÷T=321.54×ΔA÷Cpr(2)按照样本质量计算
酶活单位定义:每克组织每分钟生成 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。
TPI(nmol/min/g 鲜重)= ΔA÷(ε×d)×V 反总÷(W ×V 样÷V 样总) ÷T=321.54×ΔA÷WV 反总:反应体系总体积,0.2mL;ε:NADH 摩尔消光系数,6.22×103L / mol /cm;d:比色皿光径,1cm;V 样:加入样本体积,0.02mL;V 样总:加入提取液体积,1mL;T:反应时间,5 min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g
b. 用 96 孔板测定的计算公式如下
(1)按照样本蛋白浓度计算
酶活单位定义:每毫克组织蛋白每分钟生成 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。
TPI(nmol/min/mg prot)= ΔA÷(ε×d)×V 反总÷(V 样×Cpr) ÷T= 643.08×ΔA÷Cpr
(2)按照样本质量计算
酶活单位定义:每克组织每分钟生成 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。
TPI(nmol/min/g 鲜重)= ΔA÷(ε×d)×V 反总÷(W ×V 样÷V 样总) ÷T= 643.08×ΔA÷WV 反总:反应体系总体积,0.2mL;ε:NADH 摩尔消光系数,6.22×103L / mol /cm;d:比色皿光径,0.5cm;V 样:加入样本体积,0.02mL;V 样总:加入提取液体积,1mL;T:反应时间,5 min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g