醇脱氢酶(ADH)测试盒
注意:正式测定之前选择 2-3 个预期差异大的样本做预测定。
测定意义:
ADH 是生物体内短链醇代谢的关键酶,催化乙醇与乙醛可逆转换,在很多生理过程中起着重要作用。哺乳动物 ADH 主要在肝脏生成,肝脏损伤导致 ADH 释放到血清中。血清 ADH活性高低反映了肝功能是否异常。
测定原理:
ADH 催化 NADH 还原乙醛生成乙醇和 NAD+,NADH 在 340nm 处有吸收峰,而 NAD+没有;测定 340nm 吸光度下降速率,来计算 ADH 活性。
自备仪器和用品:
研钵、冰、低温离心机、紫外分光光度计、1mL 石英比色皿、可调式移液器和蒸馏水。
试剂组成和配制:
试剂一:液体×1 瓶,室温保存。
试剂二:液体×1 瓶,4℃保存。临用前把试剂三转移到试剂二中,4℃保存。
试剂三:粉剂×1 瓶,-20℃保存。
试剂四:液体×1 支,4℃保存。
粗酶液提取:
1、 组织:按照组织质量(g):试剂一体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议称取约 0.1g 组织,加入 1mL 试剂一)进行冰浴匀浆。16000g,4℃离心 20min,取上清置冰上待测。
2、 细菌、真菌:按照细胞数量(104 个):试剂一体积(mL)为 500~1000:1 的比例(建议 500 万细胞加入 1mL 试剂一),冰浴超声波破碎细胞(功率 300w,超声 3 秒,间隔 7秒,总时间 3min);16000g, 4℃离心 20min,取上清液置冰上待测。
3、血清等液体:直接测定。
ADH 测定操作:
1. 分光光度计预热 30 min,调节波长到 340 nm,蒸馏水调零。
2. 试剂二在 25℃水浴中保温 30 min。
3. 空白管:在 1mL 石英比色皿中依次加入 100μL 蒸馏水、800μL 试剂二和 100μL 试剂四,迅速混匀后于 340nm 测定吸光值变化,分别记录 15s 和 75s 时吸光值,分别记为 A1 和A2。△A 空白管=A1-A2。。
4. 测定管:在 1mL 石英比色皿中依次加入 100μL 上清液、800μL 试剂二和 100μL 试剂四,迅速混匀后于 340nm 测定吸光值变化,分别记录 15s 和 75s 时吸光值,分别记为 A3 和A4。△A 测定管=A3-A4。
注意:空白管只需测定一次。
计算公式:
(1)按照蛋白浓度计算
活性单位定义:25℃中每毫克蛋白每分钟氧化 1μmol NADH 为 1 个酶活单位。
ADH (μmol/min/mg prot) =[(△A 测定管–△A 空白管)÷ε÷d×V 反总×106] ÷(Cpr×V 样)÷T=1.61×(△A 测定管–△A 空白管) ÷Cpr
(2)按照样本质量计算
活性单位定义:25℃中每克组织每分钟氧化 1μmol NADH 为 1 个酶活单位。
ADH (μmol/min/g 鲜重) =[(△A 测定管–△A 空白管)÷ε÷d×V 反总×106] ÷(W×V 样÷V 样总)÷T=1.61×(△A 测定管–△A 空白管) ÷W
(3)按细胞数量计算
活性单位定义:25℃中每 104 个细胞每分钟氧化 1μmol NADH 为 1 个酶活单位。
ADH (μmol/min/104cell) = [(△A 测定管–△A 空白管)÷ε÷d×V 反总×106] ÷(细胞数量×V 样÷V样总)÷T=1.61×(△A 测定管–△A 空白管) ÷细胞数量
(4)按液体体积计算
活性单位定义:25℃中每毫升血清每分钟氧化 1μmol NADH 为 1 个酶活单位。
ADH (μmol/min/mL) = [(△A 测定管–△A 空白管)÷ε÷d×V 反总×106] ÷V 样÷T=1.61×(△A 测定管–△A 空白管)ε:NADH 摩尔消光系数,6.22×103
L/mol/cm;d:比色皿光径,1 cm;V 反总:反应体系总体积,1000μL=0.001 L;Cpr:上清液蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;V 样:加入
反应体系中上清液体积,100μL=0.1 mL;T:反应时间,1min。
注意事项:
1. 上清液蛋白质浓度需要另外测定,建议使用本公司 BCA 蛋白质含量测定试剂盒。
2. 配制好的试剂二 3 天使用完。