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淀粉脱分支酶(DBE)测试盒 BES-BK2392B

淀粉脱分支酶(DBE)测试盒

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淀粉脱分支酶(DBE)测试盒

正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定

测定意义

DBE 能够专一性地裂解支链淀粉的α-1,6 糖苷键,产生线性的葡萄糖链,在调整支链淀粉分子的链长方面有重要的作用。

测定原理

采用 3,5-二硝基水杨酸法测定 DBE 催化支链淀粉产生的还原糖,通过测定还原糖含量的变化来计算 DBE 活性。

需自备的的仪器和用品

可见分光光度计、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1mL 玻璃比色皿、研钵、冰、蒸馏水

试剂的组成和配制

提取液:液体 60mL×1 瓶,4℃保存;

试剂一:液体 15mL×1 瓶,4℃保存;

试剂二:粉剂×1 支,4℃保存;临用前每支加入 6mL 试剂一,充分混匀后备用;用不完的试剂 4℃保存;

试剂三:液体 12mL×1 瓶,4℃保存;

试剂四:液体 35mL×1 瓶,4℃保存。

粗酶液提取

按照组织质量(g):提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议称取约 0.1g 组织,加入 1mL提取液),进行冰浴匀浆。15000g 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。

测定步骤

1、分光光度计或酶标仪预热 30min 以上,调节波长到 540 nm,蒸馏水调零。

2、加样表

2021091508015346433

混匀,95℃水浴 5min,于 1mL 玻璃比色皿 540nm 处读取各管吸光值。ΔA=A 测定-A 对照。每个测定管需设个一个对照管。

注意:可以在不同对照管中加入不同样品的粗酶液,然后集中进行 5min 95℃沸水浴处理。DBE 活力单位的计算

标准条件测定回归方程为 y = 3.8458x - 0.165;x 为标准品浓度(mg/mL),y 为吸光值。

(1)按照蛋白浓度计算

单位的定义:每 mg 组织蛋白每 h 催化产生 1mg 葡萄糖定义为一个酶活力单位。

DBE 活力(mg /min /mg prot)=[ (ΔA+0.165)÷3.8458×V 反总]÷(V 样×Cpr)÷T=0.26× (ΔA+0.165) ÷Cpr

(2)按样本鲜重计算

单位的定义:每 g 组织每分钟催化产生 1mg 葡萄糖定义为一个酶活力单位。

DBE 活力(mg /min /g 鲜重)=[ (ΔA+0.165)÷3.8458×V 反总]÷(W× V 样÷V 样总)÷T=0.26× (ΔA+0.165) ÷WV 反总:反应体系总体积,0.4mL; V 样:加入样本体积,0.2mL;V 样总:加入提取液体积,1 mL;T:反应时间,2 h;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g。标准曲线线性范围为 0.1mg/mL-1mg/mL。ΔA 线性范围为 0.01-2。


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