糜蛋白酶测试盒
注意:正式测定之前选择 2-3 个预期差异大的样本做预测定。
测定意义:
糜蛋白酶,又称胰凝乳蛋白酶,是胰腺分泌的一种蛋白水解酶,能迅速分解变性蛋白质。糜蛋白酶的功能与胰蛋白酶相似,但是具有分解能力强、毒性低和不良反应小等优点。临床上糜蛋白酶用于痰液稀化,对脓性和非脓性痰液均有效;也用于创伤或手术后伤口愈合,如白内障摘除。
测定原理:
糜蛋白酶催化 N-Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA 水解,产物在 410nm 有特征光吸收;通过测定 410nm 光吸收增加速率,来计算糜蛋白酶活性。
自备仪器和用品:
台式离心机、水浴锅、可调式移液器、研钵、分光光度计、1mL 玻璃比色皿、冰和蒸馏水。
试剂组成和配制:
提取液:液体 60mL×1 瓶,4℃保存。
试剂一:液体 60mL×1 瓶,4℃保存。
试剂二:粉剂×1 瓶,-20℃避光保存。
粗酶液提取:
组织样品:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议称取约 0.1g 组织,加入 1mL 提取液)冰浴匀浆,8000g,4℃离心 10min,取上清,即粗酶液。
测定步骤:
1.分光光度计预热 30min,调节波长到 410 nm,蒸馏水调零。
2. 试剂二的配制:临用前加入 50 mL 试剂一充分溶解,置于 37℃水浴中预热 5min,用不完的试剂 4℃保存一周。
3.1mL 玻璃比色皿中加入 100μL 粗酶液,900μL 试剂二,立即混匀并在 37℃下测定 410nm处 3min 时吸光值 A1 与 8min 时吸光值 A2,记为△A=A2-A1。
糜蛋白酶活性计算公式:
(1)按蛋白浓度计算
活性单位定义:37℃每毫克蛋白每分钟催化产生 1nmol 4-硝基苯胺为一个酶活单位。
糜蛋白酶(U/mg prot)=△A ×V 反总÷(ε×d)÷(Cpr×V 样)÷T×109=227×△A÷Cpr
(2)按样本质量计算
活性单位定义:37℃每克样品每分钟催化产生 1nmol 4-硝基苯胺为一个酶活单位。
糜蛋白酶(U/g 鲜重)=△A ×V 反总÷(ε×d)÷(W×V 样÷V 样总)÷T×109=227×△A÷WV 样:加入反应体系中粗酶液体积,0.1mL;V 样总:粗酶液总体积,1 mL;V 反总:反应总体积,1mL;ε:4-硝基苯胺摩尔消光系数,8800 L / mol /cm;d:比色皿光径,1cm; T:反应时间,5min; W:样品质量,g;Cpr:粗酶液蛋白质浓度,mg/mL。