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糜蛋白酶测试盒 BES-BK2368B

糜蛋白酶测试盒

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 糜蛋白酶测试盒

注意:正式测定之前选择 2-3 个预期差异大的样本做预测定。

测定意义:

糜蛋白酶,又称胰凝乳蛋白酶,是胰腺分泌的一种蛋白水解酶,能迅速分解变性蛋白质。糜蛋白酶的功能与胰蛋白酶相似,但是具有分解能力强、毒性低和不良反应小等优点。临床上糜蛋白酶用于痰液稀化,对脓性和非脓性痰液均有效;也用于创伤或手术后伤口愈合,如白内障摘除。

测定原理:

糜蛋白酶催化 N-Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA 水解,产物在 410nm 有特征光吸收;通过测定 410nm 光吸收增加速率,来计算糜蛋白酶活性。

自备仪器和用品:

台式离心机、水浴锅、可调式移液器、研钵、酶标仪、96 孔板、冰和蒸馏水。

试剂组成和配制:

提取液:液体 100mL×1 瓶,4℃保存。

试剂一:液体 25mL×1 瓶,4℃保存。

试剂二:粉剂×1 瓶,-20℃避光保存。

粗酶液提取:

组织样品:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议称取约 0.1g 组织,加入 1mL 提取液)冰浴匀浆,8000g,4℃离心 10min,取上清,即粗酶液。

测定步骤:

1.酶标仪预热 30min,调节波长到 410 nm。

2. 试剂二的配制:临用前加入 20 mL 试剂一充分溶解,置于 37℃水浴中预热 5min,用不完的试剂 4℃保存一周。

3.96 孔板中加入 20μL 粗酶液,180μL 试剂二,立即混匀并在 37℃下测定 410nm 处 3min时吸光值 A1 与 8min 时吸光值 A2,记录△A=A2-A1。

糜蛋白酶活性计算公式:

(1)按蛋白浓度计算

活性单位定义:37℃每毫克蛋白每分钟催化产生 1nmol 4-硝基苯胺为一个酶活单位。

糜蛋白酶(U/mg prot)=△A ×V 反总÷(ε×d)÷(Cpr×V 样)÷T×109=454×△A÷Cpr

(2)按样本质量计算

活性单位定义:37℃每克样品每分钟催化产生 1nmol 4-硝基苯胺为一个酶活单位。

糜蛋白酶(U/g 鲜重)=△A ×V 反总÷(ε×d)÷(W×V 样÷V 样总)÷T×109=454×△A÷WV 样:加入反应体系中粗酶液体积,0.02mL;V 样总:粗酶液总体积,1 mL;V 反总:反应总体积,0.2mL;ε:4-硝基苯胺摩尔消光系数,8800 L / mol /cm;d:96 孔板光径,0.5cm;T:反应时间,5min; W:样品质量,g;Cpr:粗酶液蛋白质浓度,mg/mL。


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