6-磷酸葡糖糖酸脱氢酶（6PGDH）测试盒

注意：正式测定之前选择 2-3 个预期差异大的样本做预测定。

测定意义：

磷酸戊糖途径途径中 6-磷酸葡萄糖脱氢酶（G6PDH）和 6PGDH 依次催化 NADPH 合成，与能量的平衡、生长速率和细胞活力等密切相关。此外，6PGDH 逆境生理中具有重要作用。

测定原理：

6PGDH 催化 6-磷酸葡萄糖酸和 NADP+生成 NADPH，NADPH 在 340 nm 有特征吸收峰，而NADP+没有；通过测定 340nm 吸光度增加速率，计算 6PGDH 活性。

自备仪器和用品：

紫外分光光度计、低温离心机、水浴锅、可调式移液枪、1mL 石英比色皿和蒸馏水。

试剂组成和配制：

提取液：液体 60mL×1 瓶，4℃保存。

试剂一：液体 47.5mL×1 瓶，4℃保存。

试剂二：粉剂×1 瓶，-20℃避光保存。

试剂三：粉剂×1 瓶，-20℃保存。

粗酶液提取：

1、细菌、细胞或组织样品的制备：

细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为 1000~5000：1 的比例（建议 2000 万细菌或细胞加入 1mL提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30次）；8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

2、血清（浆）样品：直接检测。

测定操作：

1. 分光光度计预热 30min，调节波长到 340 nm，蒸馏水调零。

2. 将试剂二和试剂三转移至试剂一中充分溶解；在 37℃（哺乳动物）或 25℃（其它物种）水浴 10min 以上；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。

3. 取 1mL 石英比色皿，依次加入 50μL 样本和 950μL 试剂一，于 340nm 处测定 3min 内吸光值变化，第 10 s 吸光值记为 A1，第 190s 吸光值记为 A2。△A=A2-A1

注意：空白管只需要做一次。

计算公式：

1、血清（浆）6PGDH 活力的计算:

单位的定义：每 mL 血清（浆）每分钟生成 1 nmol 的 NADPH 定义为一个酶活力单位。

6PGDH（nmol/min/mL）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷V 样÷T=1071.8×ΔA

2、组织、细菌或细胞中 6PGDH 活力的计算:

（1）按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：每 mg 组织蛋白每分钟生成 1 nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。

6PGDH（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(V 样×Cpr) ÷T=1071.8×ΔA÷Cpr

（2）按样本鲜重计算：

单位的定义：每 g 组织每分钟生成 1 nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。

6PGDH（nmol/min /g 鲜重）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(W× V 样÷V 样总) ÷T=1071.8×ΔA÷W

（3）按细菌或细胞密度计算：

单位的定义：每 1 万个细菌或细胞每分钟生成 1 nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。

6PGDH（nmol/min /104 cell）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(2000×V 样÷V 样总) ÷T=0.536×ΔAV 反总：反应体系总体积，1×10-3 L；ε：NADPH 摩尔消光系数，6.22×103 L / mol /cm；d：比色皿光径，1cm；V 样：加入样本体积，0.05 mL；V 样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，3 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；2000：细菌或细胞总数，2000 万。