几丁质酶测试盒
注意:正式测定之前选择 2-3 个预期差异大的样本做预测定。
测定意义:
几丁质主要存在于虾、蟹、昆虫等甲壳类动物的外壳与软体动物的器官(例如乌贼的软骨),以及真菌类的细胞壁中。而几丁质酶(EC 3.2.1.14)可催化几丁质水解,具有抵御真菌侵染的作用,成为抗真菌病害的研究热点。
测定原理:
几丁质酶水解几丁质产生 N-乙酰氨基葡萄糖,进一步与 DNS 试剂反应产生棕红色化合物,在 540nm 处有特征吸收峰,吸光值增加速率反映了几丁质酶的活性。
自备实验用品及仪器
天平、水浴锅、离心机、分光光度计、1mL 玻璃比色皿、蒸馏水。
试剂组成和配制:
提取液:液体 100mL×1 瓶,4℃保存。
试剂一:液体 12mL×1 瓶,4℃保存。
试剂二:液体 30mL×1 瓶,4℃避光保存。
粗酶液提取:
组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议称取约 0.1g 组织,加入 1mL 提取液)进行冰浴匀浆,然后 10000g,4℃离20min,取上清,置冰上待测。
2. 真菌:按照细胞数量(104 个):提取液体积(mL)为 500~1000:1 的比例(建议 500万细胞加入 1mL 提取液),冰浴超声波破碎细胞(功率 300w,超声 3 秒,间隔 7 秒,总时间 3min);然后 10000g,4℃,离心 20min,取上清置于冰上待测。
3. 培养液:直接测定。
测定操作表:
计算公式:
标准条件下测定回归方程为 y = 6.4108x - 0.2753,R2 = 0.9984;x 为标准品浓度(mg/mL),y 为吸光值。
1、 按照样本重量计算
酶活性定义:37℃条件下,每克组织每小时分解几丁质产生 1mg N-乙酰氨基葡萄糖的酶量为一个酶活性单位。
几丁质酶活性(mg/h/g 鲜重)=(ΔA+ 0.2753)÷6.4108×V 反总÷(V 样÷V 样总×W) ÷T×10= 3.899×(ΔA+ 0.2753)÷W
2、 按照蛋白质浓度计算
酶活定义:37℃条件下,每毫克蛋白每小时分解几丁质产生 1mgN-乙酰氨基葡萄糖的酶量为一个酶活单位。
几丁质酶活性(mg/h mg prot)=(ΔA+ 0.2753)÷6.4108×V 反总÷(V 样×Cpr) ÷T×10= 3.899×(ΔA+ 0.2753)÷Cpr
3、 按细胞数量计算
酶活定义:37℃条件下,每 104个细胞每小时分解几丁质产生 1mgN-乙酰氨基葡萄糖的酶量为一个酶活单位。
几丁质酶活性(mg/h /104 cell)=(ΔA+ 0.2753)÷6.4108×V 反总÷(V 样÷V 样总×细胞数量)×10= 3.899×(ΔA+ 0.2753)÷细胞数量
4、按液体体积计算
酶活定义:37℃条件下,每毫升培养液每小时分解几丁质产生 1mg N-乙酰氨基葡萄糖的酶量为一个酶活单位。
几丁质酶活性(mg/h /mL)=(ΔA+ 0.2753)÷6.4108×V 反总÷V 样×10= 3.899×(ΔA+ 0.2753)V 反总:反应体系总体积,1 mL;V 样:反应体系中样本体积,0.4mL;V 样总:加入提取液体积,1mL;W:样本质量,g;Cpr:样本蛋白浓度,mg/mL;10,稀释倍数。
注意事项:
1、 如果吸光值超过 4,说明样本中还原糖含量较高,需要额外稀释,并在最后结果中乘以相应倍数。