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氨基比林-N-去甲基化酶(AND)测试盒 BES-BK2263B

氨基比林-N-去甲基化酶(AND)测试盒

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 氨基比林-N-去甲基化酶(AND)测试盒


注意;正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。

测定意义:

细胞色素P450酶是一组在外源物质代谢中,尤其是药物和毒物,具有重要作用的酶系。AND作为P450酶系的重要一员,相当于CYP3A4亚型,与药物的去甲基化反应密切相关。

测定原理;

AND催化氨基比林释放甲醛,通过Nash比色法测定甲醛含量,即可计算出AND活性。

自备仪器和用品:

可见分光光度计、普通离心机,超速离心机、水浴锅、可调式移液枪、lmL 玻璃比色皿、蒸馏水、无水乙醇和冰。

试剂组成和配制;

试剂一:粉剂x1瓶,4'C保存。临用前加50mL蒸馏水充分溶解。

试剂二:液体x1瓶,4C保存。

试剂三:粉剂x1 瓶(棕色瓶),4'C避光保存。临用前加入2.6 mL无水乙醇,充分溶解。

试剂四:粉剂x1 瓶,4'C保存。临用前加入2.6 mL蒸馏水,充分溶解。

试剂五:粉剂x1瓶,室温保存。临用前加蒸馏水10mL充分溶解。

试剂六:液体x1瓶,室温保存。

试剂七:液体x1瓶,4C保存。

标准液:液体x1瓶,-20°C保存。 临用前取1.5mLEP管,加入10ul标准液,加990ul蒸馏水,混匀即为0.05 mmol/L标准甲醛溶液,4'C保存。

粗酶液提取:

1、除去细胞核,线粒体等大分子物质:称约0.5g组织,加入1 mL试剂一,冰上充分研磨,10 000g 4'C离心30min,取上清液转入超速离心管。

2、 粗制微粒体: 4C, 100 00g, 离心60min, 弃上清液。

3、除血红蛋白等杂质:向步骤2的沉淀中加1mL试剂- -,盖紧后充分震荡溶解,100 000g离心30min,弃上清液。

4、最终微粒体:向步骤3的沉淀中加试剂二0.5 mL,盖紧后充分震荡溶解,即粗酶液,待测。该待测液需当天使用。

AND活性测定操作: .

1.分光光度计预热30 min,调节波长到412 nm,蒸馏水调零。

2.试剂二置于37C水浴中预热30min。

3. 对照管:取1支EP管,加入50uL粗酶液,850uL试剂二,50uL试剂三,50μL蒸馏水,混匀后置于37"C水浴保温30min;立即加入175μuL 试剂五,混匀后置于冰浴中5min;取出后加入175μL试剂六,混匀后室温静置5min;室温8000rpm离心5min;取新的EP管,加入500uL上清液,500uL 试剂七,混匀后60C水浴10min, 然后取出,用冷水冷却5min,于412nm测定光吸收,记为A对照管。

4.测定管:取1支EP管,加入50uL粗酶液,850uL试剂二,50uL试剂三,50μL试剂四,混匀后置于37"C水浴保温30min;立即加入175μL 试剂五,混匀后置于冰浴中5min;取出后加入175μuL试剂六,混匀后室温静置5min;室温8000rpm离心5min;取1支新EP管,加入500uL.上清液,500uL 试剂七,混匀后60C水浴10min,然后取出,用冷水冷却5min,于412nm测定光吸收,记为A测定管。

5.标准管:取1支EP管,加入500uL标准品,500uL试剂七,混匀后60C水浴10min,然后取出,用冷水冷却5min,于412nm测定光吸收,记为A标准管。

注意:每个样品都需要做对照管。

AND活性计算:

()按照蛋白浓度计算:

活性单位定义: 37C中每分钟每毫克蛋白催化产生Inmol 甲醛为1个酶活单位。

AND活性(nmo/min/mg prot)= C标准品xV标准品x (A 测定管-A对照管) +A标准管x稀释倍数+ (CprxV样) +T=45x(A测定管--A空白管)+A标准管+Cpr(2).按照样本质量计算:

活性单位定义: 37C中每分钟每克样品催化产生1nmol甲醛为1个酶活单位。

AND活性(nmol/min/g鲜重)= C标准品xV标准品x (A测定管- A对照管) +A标准管x稀释倍数+(WxV样)+T=45x (A测定管一A对照管) +A标准管+WC标准品: 0.05 mmol/L=50umol/L; V标准品: 500uL=0.0005 L;稀释倍数: V反总+V上清液= (50+850 +50+50+175+175) +500=2.7; Cpr:粗酶液蛋白质浓度mg/mL,需要另外测定,建议使用本公司BCA蛋白质含量测定试剂盒; V样:加入粗酶液体积,50uL=0.05mL; W:样本质量,g ; T:反应时间,30min。

注意事项:

1、粗酶液需在当日完成测定,如需保存,则向粗酶液提取步骤3的沉淀中加0.5ml 20%的甘油,分装后,-80"C 保存;

2、试剂三和试剂四需临用前配制,如当天没有用完,4'C避光保存,可用1周;

3、粗酶液可直接用于蛋白浓度测定,建议用BCA法测蛋白含量。


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