NADPH-细胞色素C还原酶（NCR）测试盒

注意:正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。

测定意义:

细胞色素P450酶是- -组 主要存在于肝脏的同工酶，在外源物质代谢中具有重要作用，尤其是药物和毒物的代谢。NCR作为P450酶系的重要一员， 催化氧化型P450还原再生。

测定原理: .

NCR催化NADPH还原氧化型细胞色素c生成还原型细胞色素c,还原型细胞色素c在550nm处有特征吸收峰;通过测定550nm吸光度的增加速率，来计算NCR活性。

自备仪器和用品:

可见分光光度计、普通离心机，超速离心机、可调式移液枪、1lmL 玻璃比色皿和蒸馏水。

试剂组成和配制:

试剂一:粉剂x1瓶，4C保存。临用前加100mL蒸馏水充分溶解。

试剂二:液体x1 瓶，4'C保存。

试剂三:粉剂x1瓶，-20°C保存。 临用前配制，加2.6 mL蒸馏水充分溶解，4C保存。

试剂四:粉剂x1瓶，4'C保存。 临用前配制，加550 μL蒸馏水充分溶解，4C保存。

粗酶液提取:

1、除去细胞核和线粒体等:称约0.5g组织，加入4C预冷的1 mL试剂一，冰上充分研磨，10 000g 4'C离心30min，取上清液，转移到超速离心管中。

2、粗制微粒体: 4C，100 00g，离心60min,弃上清液。

3、除血红蛋白等杂质:向步骤2的沉淀中加1 mL试剂-，盖紧后充分震荡溶解，100 000g离心30min,弃上清液。

4、最终微粒体:向步骤3的沉淀中加试剂二0.5 mL，盖紧后充分震荡溶解，4C保存待测。

测定操作:

1.分光光度计预热30 min，调节波长到550 nm,蒸馏水调零。

2.试剂二在37"C水浴中预热30min。

3.空白管:取1mL玻璃比色皿,依次加入50μL蒸馏水、900uL试剂二、50μuL试剂三和10μL试剂四，迅速混匀后于550nm处测定2min内吸光值变化，第10s和第130 s吸光值分别记为A1和A2，△A空白管=A2-A1。

4.测定管:取1mL玻璃比色皿，依次加入50uL粗酶液、900uL试剂二、50uL试剂三和10pL试剂四，迅速混匀后于550nm处测定2min内吸光值变化，第10 s和第130 s吸光值分别记为A3和A4，△A测定管=A4-A3。

注意:空白管只需要做-一次。

计算公式:

(1).按照蛋白浓度计算

活性单位定义: 37"C中， 每毫克蛋白每分钟催化产生Inmol还原型细胞色素C为1个酶活单位。

NCR酶活性(nmo/min/mg prot)= (OA测定管-OA空白管)+ε+dxV反总+ (CprxV 样) +T= 529x(△A测定管-OA空白管)+Cpr

(2)按照样本质量计算

活性单位定义: 37"C中， 每克样品每分钟催化产生Inmol 还原型细胞色素C为1个酶活单立。

NCR酶活性(nmo/min/g鲜重)= (OA测定管-OA空白管)+ε+dxV反总+ (WxV样+V样总)+T= 265*(OA测定管-△A空白管)+Wε: 还原型细胞色素C摩尔消光系数，19100L/mol/cm=0.0191L/umol/cm; d:比色皿光径，cm; V反总:反应体系总体积，1010uL=0.00101L; Cpr: 上清液蛋白质浓度，mg/mL， 需要另外测定; V样:加入反应体系中上清液体积，50uL=0.05mL; V样总:加入提取液体积，0.5mL; W:样本质量，g; T:反应时间，2min。

注意事项:

试剂三、试剂四临用前配制，配好未使用完的4'C可保存两天。