红霉素-N-脱甲基酶(ERND)测试盒
注意:正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。
测定意义:
细胞色素P450酶是一-组主要存在于肝脏的酶系,在外源物质代谢中,尤其是药物和毒物的代谢,具有重要作用。ERND在P450酶系中相当于CYP2B亚型,与药物代谢的去甲基化密切相关。CYP2B具有催化底物形成非活性易于排泄的代谢产物而具有解毒作用,也可使某些药物经CYP2B代谢活化。
测定原理:
ERND催化红霉素释放甲醛,通过Nash比色测定甲醛含量,即可计算出ERND活性。
自备仪器和用品:
普通离心机,超速离心机、可调式移液枪、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板、蒸馏水和冰。
试剂组成和配置:
试剂一:粉剂X 1瓶,4'C保存。临用前加100mL蒸馏水溶解。
试剂二:液体X1瓶,4C保存。
试剂三:粉剂X1管,4'C保存。临用前加1mL蒸馏水,充分溶解。
试剂四:粉剂X 1瓶,4C保存。临用前加0.5mL蒸馏水,充分溶解。
试剂五:粉剂X1瓶,4C保存。临用前,加蒸馏水4.5mL充分溶解。
试剂六:液体X1瓶,4'C保存。
试剂七:液体X1瓶,4'C保存。
标准液:液体X1瓶,-20C保存。临用前取1.5mL EP管,加入10ul 标准液,加990μl蒸馏水,混匀即为0.05 mmol/L标准甲醛溶液,4C 保存。
粗酶液提取:
1、除去细胞核,线粒体等大分子物质:称约0.5g组织,加入1mL试剂一,冰上充分研磨,10 000g 4C离心30min,取上清液,转入超速离心管中。
2、粗制微粒体: 100 000g,4"C, 离心60min,弃上清液。
3、除血红蛋白等杂质:向步骤2的沉淀中加lmL试剂一,盖紧后充分震荡溶解,100 000g离心30min,弃上清液。
4、最终微粒体:向步骤3的沉淀中加试剂二0.5mL,充分震荡溶解,即粗酶液,待测。该待测液需当天使用。
测定操作:
1.分光光度计/酶标仪预热30 min, 调节波长到412 nm, 蒸馏水调零。
2.试剂二置于37"C水浴中预热30 min。
3.对照管:取0.5mL EP管,加入10yuL粗酶液,170uL 试剂二,10yL 试剂三,10uL 蒸馏水,混匀后置于37°C水浴保温30min;立即加入35uL试剂五,混匀后置于冰浴中5min;取出后加入35uL试剂六,混匀后室温静置5min;室温8000rpm离心5min;取新的EP管,加入100uL.上清液,100uL 试剂七,混匀后60"C水浴10min,然后取出,用冷水冷却5min,于412nm测定光吸收,记为A对照管。
4.测定管:取0.5mL EP管,加入10μL粗酶液,170uL 试剂二,10μL 试剂三,10uL 试剂四,混匀后置于37C水浴保温30min;立即加入35μuL试剂五,混匀后置于冰浴中5min;取出后加入35μL试剂六,混匀后室温静置5min;室温8000rpm离心5min;取新EP管,加入100uL.上清液,100μL 试剂七,混匀后60°C水浴10min,然后取出,用冷水冷却5min,于412nm测定光吸收,记为A测定管。
5.标准管:取0.5mL EP管,加入100uL标准品,100uL试剂七,混匀后60"C水浴10min,
然后取出,用冷水冷却5min,于412nm测定光吸收,记为A标准管。
注意:每个样品都需要做对照管。
ERND活性计算公式:
a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下
(1).按照蛋白浓度计算:
活性单位定义: 37°C 下,每分钟每毫克蛋白催化产生1nmol甲醛为1个酶活单位。
ERND活性(nmo/min/mg prot) = C标准品xV标准品x (A测定管- A对照管) +A标准管x稀释倍数+ (CprxV 样) +T=45x (A测定管一A对照管) +A标准管+Cpr.
(2).按照样本质量计算:
活性单位定义: 37°C 下,每分钟每克样品催化产生Inmol甲醛为1个酶活单位。
ERND活性(nmol/min/g鲜重) = C标准品xV标准品x (A测定管- -A对照管) +A标准管x稀释倍数+ (WxV样) +T=45x (A测定管一A对照管) +A标准管+W
C标准品: 0 05 mmol/I.=50ymol/L; V标准品: 100I.=1X10+I; 稀释倍数: V反总+V上清液= (50+850 +50+50+175+175)六500=2.7; Cpr: 粗酶液蛋白质浓度(mg/mL), 需要另外测定,建议使用本公司BCA蛋白质含量测定试剂盒; W:样品质量,g; V样:加入粗酶液体积,10uL=0.01mL; T: 催化反应时间(min), 30min。
b.使用96孔板测定的计算公式如下
(1).按照蛋白浓度计算:
活性单位定义: 37°C 下,每分钟每毫克蛋白催化产生Inmol甲醛为1个酶活单位。
ERND活性(nmol/min/mg prot) = C标准品xV标准品x (A测定管-A对照管) +A标准管x稀释倍数+ (CprxV 样) +T=45x (A测定管一A对照管) +A标准管+Cpr。
(2).按照样本质量计算:
活性单位定义: 37C 下,每分钟每克样品催化产生1nmol甲醛为1个酶活单位。
ERND活性(nmo/min/g鲜重) = C标准品xV标准品x (A测定管一A对照管) +A标准管x稀释倍数+ (WxV样) +T=45x (A测定管一A对照管) +A标准管+W