苯胺-4羟化酶(AH)测试盒
注意:正式测定之前选择 2-3 个预期差异大的样本做预测定。
测定意义:
细胞色素 P450 酶是一组主要存在于肝脏的同工酶,在外源物质代谢中具有重要作用,尤其是药物和毒物的代谢。AH 在 P450 酶系中相当于 CYP2E1 亚型,CYP2E1 不仅参与了药物的代谢,而且还能催化多种前致癌物和前毒物的活化过程。
测定原理:
AH 催化苯胺羟化后产生的 4-氨基酚,进一步转变为酚-吲哚复合物,在 630nm 处有特征吸收峰;通过测定 630nm 吸光度增加速率,来计算 AH 活性。
自备仪器及用品:
普通离心机、超速离心机、可见分光光度计/酶标仪、微量玻璃比色皿/96 孔板、双蒸水和冰。
试剂组成和配制:
试剂一:粉剂×1 瓶,4℃保存。临用前加入 100mL 蒸馏水,充分溶解。
试剂二:液体×1 瓶,4℃保存。
试剂三:粉剂×1 瓶,4℃保存。临用前加入 10mL 蒸馏水,充分溶解。
试剂四:粉剂×1 瓶,4℃保存。临用前加入 5mL 蒸馏水,充分溶解。
试剂五:液体×1 瓶,4℃保存。
试剂六:粉剂×1 瓶(腐蚀性试剂),4℃避光保存。临用前加入 10mL 蒸馏水,充分溶解。
试剂七:粉剂×1 瓶,4℃保存。临用前加入 10mL 蒸馏水充分溶解。
标准液:液体×1 瓶,100μmol/L,4℃避光保存。
粗酶液提取:
1、除去细胞核,线粒体等大分子物质:称约 0.5g 组织,加入 1mL 试剂一,冰上充分研磨,10 000g 4℃,离心 30min,取上清液,转移到超速离心管中。
2、粗制微粒体: 100 000g 4℃,离心 60min,弃上清液。
3、除血红蛋白等杂质:向步骤 2 的沉淀中加 1mL 试剂一,盖紧后充分震荡溶解,100 000g离心 30min,弃上清液。
4、最终微粒体:向步骤 3 的沉淀中加试剂二 0.5mL,盖紧后充分震荡溶解,即粗酶液,待测。
测定操作:
1. 分光光度计/酶标仪预热 30 min,调节波长到 630 nm,蒸馏水调零。
2. 试剂三置于 37℃水浴中预热 30min。
3. 试剂五置于冰浴预冷 30min。
4. 标准管:取 0.5 mL EP 管,加入 100μL 标准液,100μL 试剂六,100μL 试剂七,混匀后室温静置 30min,吸取 200μL 于微量玻璃比色皿/96 孔板,630 nm 测定光吸收,记为 A 标准管。
5. 对照管:取 0.5 mL EP 管,加入 50μL 粗酶液,100μL 试剂三,50μL 蒸馏水,混匀后 37℃水浴中保温 30min;再加入 100μL 试剂五,混匀后冰浴 5min,11000rpm,4℃,离心 10min;取 100μL 上清液,加入新的 0.5 mL EP 管;再加入 100μL 试剂六,100μL 试剂七,混匀后室温静置 30min,吸取 200μL 于微量玻璃比色皿/96 孔板,630 nm 测定光吸收,记为 A 对照管。
6. 测定管:取 0.5 mL EP 管,加入 50μL 粗酶液,100μL 试剂三,50μL 试剂四,混匀后 37℃水浴中保温 30min;再加入 100μL 试剂五,混匀后冰浴 5min,11000rpm,4℃,离心 10min;取 100μL 上清液,加入新的 0.5 mL EP 管;再加入 100μL 试剂六,100μL 试剂七,混匀后室温静置 30min,吸取 200μL 于微量玻璃比色皿/96 孔板,630 nm 测定光吸收,记为 A 测定管。
AH 活性计算公式:
a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下
(1)按蛋白浓度计算
活性单位定义:37℃中每毫克蛋白每分钟催化产生 1nmol 4-氨基酚为 1 个酶活单位。
AH 活性(nmol/min/mg prot) = C 标准品×V 标准品×(A 测定管-A 对照管)÷A 标准管×稀释倍数÷(Cpr×V 样)÷T= 40×(A 测定管-A 对照管)÷A 标准管÷Cpr。
(2)按样本质量计算
活性单位定义:37℃中每克样本每分钟催化产生 1nmol 4-氨基酚为 1 个酶活单位。
AH 活性(nmol/min/g 鲜重)= C 标准品×V 标准品×(A 测定管-A 对照管)÷A 标准管×稀释倍数÷(W×V 样)÷T= 40×(A 测定管-A 对照管)÷A 标准管÷W
C 标准品:100μmol/L;V 标准品:100μL=1×10-4L;稀释倍数: V 反总÷V 样=300μL÷50μL=6;Cpr:粗酶液蛋白质浓度(mg/mL),需要另外测定,建议使用本公司 BCA 蛋白质含量测定试剂盒;V 样:加入反应体系中粗酶液体积,50μL=0.05 mL;W :样品质量; T:催化反应时间(min),30min。
b.使用 96 孔板测定的计算公式如下
(1)按蛋白浓度计算
活性单位定义:37℃中每毫克蛋白每分钟催化产生 1nmol 4-氨基酚为 1 个酶活单位。
AH 活性(nmol/min/mg prot) = C 标准品×V 标准品×(A 测定管-A 对照管)÷A 标准管×稀释倍数÷(Cpr×V 样)÷T= 40×(A 测定管-A 对照管)÷A 标准管÷Cpr
(2)按样本质量计算
活性单位定义:37℃中每克样本每分钟催化产生 1nmol 4-氨基酚为 1 个酶活单位。
AH 活性(nmol/min/g 鲜重) = C 标准品×V 标准品×(A 测定管-A 对照管)÷A 标准管×稀释倍数÷(W×V 样)÷T= 40×(A 测定管-A 对照管)÷A 标准管÷W
C 标准品:100μmol/L;V 标准品:100μL=1×10-4L;稀释倍数:V 反总÷V 样=300μL÷50μL=6;Cpr:粗酶液蛋白质浓度(mg/mL),需要另外测定,建议使用本公司 BCA 蛋白质含量测定试剂盒;V 样:加入反应体系中粗酶液体积,50μL=0.05 mL;W :样品质量; T:催化反应时间(min),30min。