细胞色素b5含量测试盒

注意:正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。

测定意义:

细胞色素P450酶是- -组 主要存在于肝脏的同工酶，在外源物质代谢中具有重要作用，尤其是药物和毒物的代谢。细胞色素P450和细胞色素b5是P450酶系的两个血红素蛋白，其比值的变化与P450代谢活性密切相关。

测定原理:

氧化型细胞色素b5经连二亚硫酸钠还原后，在424nm处有最大吸收峰,通过测定424nm和490nm处吸光值的差异，即可计算出细胞色素b5的含量。

自备仪器和用品:

普通离心机，超速离心机、可调式移液枪、紫外分光光度计/酶标仪、微量玻璃比色皿/96孔板、和蒸馏水。

试剂组成和配制:

试剂一:粉剂X2瓶，4'C保存。临用前各加100mL蒸馏水，充分溶解。

试剂二:液体X1瓶，4'C保存。 

试剂三:粉剂X1瓶，4C保存。

工作液配制:临用前配制，戴一次性手套， 小心打开试剂三瓶盖，加试剂二20mL充分溶解，4C避光可保存1周。

样品中细胞色素b5提取:

1、除去细胞核，线粒体等大分子物质:称约0.5g组织，加入lmL试剂一，冰上允分研磨，10 000g 4C离心30min，取. 上清液，转入超速离心管中。

2、粗制微粒体: 100 000g，4C离心60min,弃上清液。

3、除血红蛋白等杂质:向步骤2的沉淀中加1mL试剂-一，盖紧后充分震荡溶解，100 000g离心30min,弃上清液。

4、待测液:向步骤3的沉淀中加试剂二0.5mL，盖紧后充分震荡溶解，即待测液，该待测液需当天测定。

细胞色素b5含量测定操作:

1.分光光度计/酶标仪预热30 min。

2.工作液置于25C水浴中预热30 min。

3.空白管:取1mL玻璃比色皿，加入10 μuL蒸馏水，200uL工作液，室温静置2 min, 424nm和490nm处吸光值，424nm 处吸光值记为A空白管1, 490nm处吸光值记为A空白管2。△A空白管=A空白管1-A空白管2

4.测定管:取1mL玻璃比色皿，加入10 μL待测液，200uL工作液，室温静置2 min, 424nm和490nm处吸光值，424nm 处吸光值记为A测定管1, 490nm 处吸光值记为A测定管2。△A测定管=A测定管1-A 测定管2。

样品细胞色素b5含量计算公式:

a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下

(1)按蛋白浓度计算

细胞色素b5含量(nmo/mg prot)= (OA测定管-△A空白管)+(εxd)xV反总+ (CprxV 样)= 0.1228*(OA测定管-△A空白管)+Cpr

(2)按样本质量计算

细胞色素b5含量(nmol/g鲜重)= (OA测定管-OA空白管)+(εxd)xV反总x(V样总+V样)+W= 0.0614>(OA测定管-OA空白管)+Wε:还原型细胞色素b5纳摩尔消光系数，171x 103 L/nmol/cm; d:比色皿光径(cm)，lcm;V反总:反应体系总体积，210μL=2.1x10*L; Cpr: 待测液蛋白质浓度(mg/mL)， 需要另外测定; V样:加入反应体系中待测液体积，10 μuL=0.01 mL; V样总:待测液总体积, 0.5 mL;W:样品质量(g)。

b.使用96孔板测定的计算公式如下

(1)按蛋白浓度计算

细胞色素b5含量(nmol/mg prot)= (OA测定管~△A空白管)+(εxd)xV反总+ (CprxV 样)= 0.2456*(OA测定管-△A空白管)+Cpr

(2)按样本质量计算

细胞色素b5含量(nmol/g鲜重)= (OA测定管-△A空白管)+(εxd)xV反总x(V样总+V样)+W= 0.1228*(OA测定管-△A空白管)+Wε:还原型细胞色素b5纳摩尔消光系数，171X 103 L/nmol/cm; d: 96孔板光径(cm), 0.5cm;V反总:反应体系总体积，210 μL=2.1X104 L; Cpr: 待测液蛋白质浓度(mg/mL)， 需要另外测定; V样:加入反应体系中待测液体积，10 μL=0.01 mL; V样总:待测液总体积，0.5 mL; W:样品质量(g)。