氨基比林-N-去甲基化酶（AND）测试盒

注意;正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。

测定意义:

细胞色素P450酶是一组在外源物质代谢中，尤其是药物和毒物，具有重要作用的酶系。AND作为P450酶系的重要- -员， 相当于CYP3A4亚型，与药物的去甲基化反应密切相关。

测定原理:

AND催化氨基比林释放甲醛，通过Nash比色法测定甲醛含量，即可计算出AND活性。

自备仪器和用品:

普通离心机，超速离心机、水浴锅、可调式移液枪、紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色/96孔板、蒸馏水、无水乙醇和冰。

试剂组成和配制:

试剂一:粉剂x1瓶，4C保存。临用前加100mL蒸馏水充分溶解。

试剂二:液体x1瓶，4C保存。

试剂三:粉剂x1管，4'C避 光保存。临用前加入1mL无水乙醇，充分溶解。

试剂四:粉剂x I管，4'C保存。 临用前加入0.5mL蒸馏水，充分溶解。

试剂五:粉剂x1瓶，室温保存。临用前加蒸馏水4mL充分溶解。

试剂六:液体x1瓶，室温保存。

试剂七:液体x1瓶，4'C保存。

标准液:液体x1瓶，-20°C保存。 临用前取1.5mL EP管，加入10μl标准液，加990ul蒸馏水，混匀即为0.05 mmol/L标准甲醛溶液，4C保存。

粗酶液提取:

1、除去细胞核，线粒体等大分子物质:称约0.5g组织，加入1 mL试剂一，冰上充分研磨,10 00g 4C离心30min,取上清液转入超速离心管。

2、粗制微粒体: 4'C， 100 000g，离心60min,弃上清液。

3、除血红蛋白等杂质:向步骤2的沉淀中加1mL试剂一，盖紧后充分震荡溶解，100 000g离心30min,弃上清液。

4、最终微粒体:向步骤3的沉淀中加试剂二0.5 mL，盖紧后充分震荡溶解，即粗酶液，待测。该待测液需当天使用。

AND活性测定操作:

1.分光光度计/酶标仪预热30 min,调节波长到412 nm,蒸馏水调零。

2.试剂二置于37C水浴中预热30min。

3.对照管:取1支EP管，加入10uL粗酶液，170uL试剂二，10yL试剂三，10yL蒸馏水，混匀后置于37"C水浴保温30min;立即加入35μL试剂五，混匀后置于冰浴中5min;取出后加入35uL试剂六，混匀后室温静置5min;室温8000rpm离心5min;取新的EP管，加入100uL.上清液，100uL 试剂七，混匀后60C水浴10min,然后取出，用冷水冷却5min，于412nm测定光吸收，记为A对照管。

4.测定管:取1支EP管，加入10uL粗酶液，170uL试剂二，10uL试剂三，10yL试剂四，混匀后置于37°C水浴保温30min;立即加入35uL试剂五，混匀后置于冰浴中5min;取出后加入35μL试剂六，混匀后室温静置5min;室温8000rpm离心5min;取1支新EP管，加入100uL上清液，100uL 试剂七，混匀后60C水浴10min， 然后取出，用冷水冷却5min,于412nm测定光吸收，记为A测定管。

5. 标准管:取1支EP管，加入100uL标准品，100uL试剂七，混匀后60C水浴10min,然后取出，用冷水冷却5min,于412nm测定光吸收，记为A标准管。

注意:每个样品都需要做对照管。

AND活性计算: 

a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下

(1)按蛋白浓度计算

活性单位定义: 37"C中每分钟每毫克蛋白催化产生Inmol甲醛为1个酶活单位。

AND活性(nmo/min/mg prot) = C标准品x V标准品x(A测定管- A对照管)+A标准管x稀.释倍数+ (CprxV样) +T=45x (A 测定管一A对照管) +A标准管+Cpr。

(2)按样本质量计算

活性单位定义: 37C中每分钟每克组织催化产生nmol甲醛为1个酶活单位。

AND活性(nmol/min/g鲜重) = C标准品xV标准品x (A测定管一A对照管) +A标准管x稀释倍数+(V样+V样总xW)+T=45x (A测定管-A对照管) +A标准管+W。

C标准品: 0.05 mmol/L=50umol/L; V标准品: 500uL=0.0005L; 稀释倍数: V反总+V上清液= (50+850 +50+50+175+175) +500=2.7; Cpr: 粗酶液蛋白质浓度(mg/mL),需要另外测定，建议使用本公司BCA蛋白质含量测定试剂盒; V样:加入粗酶液体积，50uL=0.05mL;V样总:提取液体积，0.5mL; T:催化反应时间(min)，30min。

b.使用96孔板测定的计算公式如下

(1)按蛋白浓度计算

活性单位定义:37°C中每分钟每毫克蛋白催化产生1nmol甲醛为1个酶活单位。

AND活性(nmol/min/mg prot) = C标准品xV标准品x (A测定管-A对照管)+A标准管x稀释倍数+ (CprxV样) +T=45x (A测定管-A对照管) +A标准管+ Cpr。

(2)按样本质量计算

活性单位定义: 37"C中每分钟每克组织催化产生nmol甲醛为1个酶活单位。

AND活性(nmo/min/g鲜重) = C标准品xV标准品x (A测定管-A对照管) +A标准管x稀释倍数+(V样+V样总xW)+T=45x(A测定管-A对照管)+A标准管+W。

C标准品: 0.05 mmol/L=50μmol/L; V标准品: 500uL=0.0005L;稀释倍数: V反总+V上清液= (50+850 +50+50+175+175) +500=2.7; Cpr:粗酶液蛋白质浓度(mg/mL)，需要另外测定，建议使用本公司BCA蛋白质含量测定试剂盒; V样:加入粗酶液体积，50uL=0.05mL;V样总:提取液体积，0.5mL; T:催化反应时间(min)， 30min。

注意事项:

1、粗酶液需在当日完成测定，如需保存，则向粗酶液提取步骤3的沉淀中加0.5ml 20%的甘油，分装后，-80C保存;

2、试剂三和试剂四需临用前配制，如当天没有用完，4'C避光保存，可用1周;

3、粗酶液可直接用于蛋白浓度测定，建议用BCA法测蛋白含量。