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丙酮酸磷酸双激酶(PPDK)测试盒 BES-BK2248B

丙酮酸磷酸双激酶(PPDK)测试盒

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丙酮酸磷酸双激酶(PPDK)测试盒

正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定

测定意义:

丙酮酸磷酸双激酶(pyruvate phosphate dikinase, PPDK, EC 2.7.9.1)是 C4 途径和景天科酸代谢途径的限速酶,催化 ATP、丙酮酸和 Pi 经三步反应生成磷酸烯醇式丙酮酸。该酶主要存在于 C4 植物的叶绿体基质中,对光合功能具有重要调节作用。

测定原理:

PPDK 的逆向反应催化磷酸烯醇式丙酮酸、AMP 和 PPi 生成丙酮酸、ATP 和 Pi,乳酸脱氢酶进一步催化丙酮酸和 NADH 生成乳酸和 NAD+,在 340nm 测定 NADH 减少速率,计算PPDK 活性。

需自备的仪器和用品:

紫外分光光度计/酶标仪、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研钵、冰和蒸馏水。

试剂的组成和配制:

提取液:100mL×1 瓶,4℃保存;

试剂一:液体 25 mL×1 瓶, 4℃保存;

试剂二:粉剂×2 瓶,-20℃保存;

试剂三 :液体 40μL×1 支,4℃保存;体积较少,若沾在管壁上,临用前可低速离心后使用。

样本的前处理:

按照组织质量(g):提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议称取约 0.1g 组织,加入 1mL提取液),进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。

测定步骤和加样表:

1、 分光光度计或酶标仪预热 30min 以上,调节波长至 340nm,蒸馏水调零。

2、 样本测定

(1)工作液的配制:临用前取试剂二一瓶加入 10mL 试剂一和 5μL 试剂三,充分混匀,置于 37℃水浴 5min;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融。

(2)在微量石英比色皿或 96 孔板中加入 10μL 样本和 190μL 工作液,混匀,立即记录 340nm处初始吸光值 A1 和 37℃反应 5min 后的吸光值 A2,计算 ΔA=A1-A2。

PPDK 活性计算:

a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下

(1)按样本蛋白浓度计算

单位定义:每 mg 组织蛋白每分钟消耗 1nmol NADH 定义为一个酶活力单位。

PPDK(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(V 样×Cpr) ÷T=643×ΔA÷Cpr

(2)按样本鲜重计算

单位定义:每 g 组织每分钟消耗 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。

PPDK(nmol/min/g 鲜重)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(W ×V 样÷V 样总)÷T=643×ΔA÷WV 反总:反应体系总体积,2×10-4L;ε:NADH 摩尔消光系数,6.22×103L / mol /cm;d:比色皿光径,1cm;V 样:加入样本体积,0.01 mL;V 样总:加入提取液体积,1 mL;T:反应时间,5 min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;500:细菌或细胞总数,500 万。

b.用 96 孔板测定的计算公式如下

(1)按样本蛋白浓度计算

单位定义:每 mg 组织蛋白每分钟消耗 1nmol NADH 定义为一个酶活力单位。

PPDK(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(V 样×Cpr) ÷T=1286×ΔA÷Cpr

(2)按样本鲜重计算

单位定义:每 g 组织每分钟消耗 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。

PPDK(nmol/min/g 鲜重)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(W× V 样÷V 样总)÷T=1286×ΔA÷WV 反总:反应体系总体积,2×10-4L;ε:NADH 摩尔消光系数,6.22×103L / mol /cm;d:96 孔板光径,0.5cm;V 样:加入样本体积,0.01 mL;V 样总:加入提取液体积,1 mL;T:反应时间,5 min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g。


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