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焦磷酸:果糖-6-磷酸-1-磷酸转移酶(PFP)测试盒 BES-BK2246B

焦磷酸:果糖-6-磷酸-1-磷酸转移酶(PFP)测试盒

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焦磷酸:果糖-6-磷酸-1-磷酸转移酶(PFP)测试盒

注意:正式测定之前选择 2-3 个预期差异大的样本做预测定。

测定意义

焦磷酸:果糖-6-磷酸-1-磷酸转移酶(PFP,EC2.7.1.90)是一种胞质酶,广泛存在于植物组织中,催化果糖-6-磷酸与果糖-1,6-二磷酸之间的可逆转化,在光合作用碳代谢中起重要作用。

测定原理

PFP 催化 6-磷酸果糖转化为 1,6-二磷酸果糖,它在醛缩酶和磷酸丙糖异构酶的作用下转变为3-磷酸甘油醛,再由 3-磷酸甘油醛脱氢酶和 NADH 催化生成 3-磷酸甘油酸、NAD 和磷酸,340nm 处的吸光度变化反映了 PFP 的活性的高低。

自备实验用品及仪器

天平、低温离心机、研钵、紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96 孔板。

试剂组成和配制

提取液:液体 100mL×1 瓶,4℃保存。

试剂一:液体 10mL×1 瓶,4℃避光保存。

试剂二:粉剂×1 瓶,-20℃避光保存。临用前加 2mL 蒸馏水充分溶解;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融。

试剂三:粉剂×1 瓶,-20℃避光保存。临用前加 2mL 蒸馏水充分溶解;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融。

试剂四:液体 1mL×1 瓶,4℃避光保存。

试剂五:液体 1mL×1 瓶,4℃避光保存。

试剂六:液体 2mL×1 瓶,4℃避光保存。

酶液提取

1. 组织:按照质量(g):提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议称取约 0.1g,加入 1mL提取液)加入提取液,冰浴匀浆后于 4℃,10000g 离心 10min,取上清置冰上待测。

2. 细胞:按照细胞数量(104 个):提取液体积(mL)为 500~1000:1 的比例(建议 500万细胞加入 1mL 提取液),冰浴超声波破碎细胞(功率 300w,超声 3 秒,间隔 7 秒,总时间 3min);然后 4℃,10000g 离心 10min,取上清置冰上待测。

3. 液体:直接检测。

测定操作

1. 紫外分光光度计/酶标仪预热 30min,调节波长至 340nm,蒸馏水调零。

2. 取微量石英比色皿/96 孔板,依次加入 100μL 试剂一,20μL 试剂二,20μL 试剂三,10μL试剂四,10μL 试剂五,20μL 试剂六,20μL 粗酶液,充分混匀,记录 340nm 处 10s 的吸光值 A1 和 310s 的吸光值 A2,△A=A1-A2

计算公式

a. 使用微量石英比色皿测定的计算公式如下

(1)按照样本蛋白浓度计算

酶活单位定义:每毫克组织蛋白每分钟消耗 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。

PFP(nmol/min /mg prot)=ΔA÷(ε×d)×V 反总÷(V 样×Cpr) ÷T=321.54×ΔA÷Cpr(2)按照样本质量计算

酶活单位定义:每克组织每分钟消耗 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。

PFP(nmol/min /g 鲜重)=ΔA÷(ε×d)×V 反总÷(W ×V 样÷V 样总) ÷T=321.54×ΔA÷W(3)按照细胞数量计算

酶活单位定义:每 104个细胞每分钟消耗 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。

PFP(nmol/min/104cell)= ΔA÷(ε×d)×V 反总÷(V 样×细胞数量÷V 样总) ÷T=321.54×ΔA÷细胞数量

(4)按照液体体积计算

酶活单位定义:每毫升液体每分钟消耗 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。

PFP(nmol/min/mL)=ΔA÷(ε×d)×V 反总÷V 样÷T=321.54×ΔAV 反总:反应体系总体积,0.2mL;ε:NADH 摩尔消光系数,6.22×103

L / mol /cm;d:比色皿光径,1cm;V 样:加入样本体积,0.02mL;V 样总:加入提取液体积,1mL;T:反应时间,5 min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g

b.使用 96 孔板测定的计算公式如下

(1)按照样本蛋白浓度计算

酶活单位定义:每毫克组织蛋白每分钟消耗 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。

PFP(nmol/min /mg prot)=ΔA÷(ε×d)×V 反总÷(V 样×Cpr) ÷T= 643.08×ΔA÷Cpr

(2)按照样本质量计算

酶活单位定义:每克组织每分钟消耗 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。

PFP(nmol/min /g 鲜重)=ΔA÷(ε×d)×V 反总÷(W ×V 样÷V 样总) ÷T= 643.08×ΔA÷W

(3)按照细胞数量计算

酶活单位定义:每 104个细胞每分钟消耗 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。

PFP(nmol/min /104

cell)= ΔA÷(ε×d)×V 反总÷(V 样×细胞数量÷V 样总) ÷T= 643.08×ΔA÷细胞数量

(4)按照液体体积计算

酶活单位定义:每毫升液体每分钟消耗 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。

PFP(nmol/min /mL)=ΔA÷(ε×d)×V 反总÷V 样÷T= 643.08×ΔAV 反总:反应体系总体积,0.2mL;ε:NADH 摩尔消光系数,6.22×103L / mol /cm;d:比

色皿光径,1cm;V 样:加入样本体积,0.02mL;V 样总:加入提取液体积,1mL;T:反应时间,5 min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g


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