乙醇酸氧化酶测试盒

注意：正式测定之前选择 2-3 个预期差异大的样本做预测定。

测定意义

乙醇酸氧化酶（EC1.1.3.1）是植物光呼吸代谢中的关键酶，也是光下合成草酸的关键酶，它催化乙醇酸氧化生成乙醛酸，对研究光呼吸代谢过程及其调控具有重要意义。

测定原理

乙醇酸氧化酶催化乙醇酸氧化生成乙醛酸，乙醛酸和盐酸苯肼反应生成乙醛酸苯腙，在324nm 有特征吸收峰。

自备实验用品及仪器

天平、低温离心机、紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96 孔板（UV 板）。

试剂组成和配制

提取液：液体 100mL×1 瓶，4℃保存。

试剂一：液体 15mL×1 瓶，4℃保存。

试剂二：粉剂×1 瓶，4℃避光保存，临用前加 5mL 双蒸水溶解；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。

试剂三：液体 2mL×1 支，4℃保存。

酶液提取

按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL提取液），进行冰浴匀浆。12000g， 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

测定操作表

充分混匀，立即于微量石英比色皿/96 孔板中测定324nm 处 10s 和 190s 吸光值 A1 和 A2，△A=A2- A1

酶活性计算公式

a．用微量石英比色皿测定的计算公式如下

1．按照蛋白浓度计算

酶活性定义：每毫克蛋白每分钟氧化 1nmol 乙醇酸所需的酶量为一个酶活力单位。

GOX 活性（nmol/min /mg prot）=dA×∆ε×V 反总÷（V 样×Cpr）÷T= 392×△A÷Cpr

2．按照样本质量计算

酶活性定义：每克组织每分钟氧化 1 nmol 乙醇酸所需的酶量为一个酶活力单位。

GOX 活性（nmol/min /g 鲜重）=dA×∆ε×V 反总÷（V 样×W÷V 样总）÷T= 392×△A÷Wε：乙醛酸苯腙毫摩尔消光系数：17L/mmol/cm；d：比色皿光径，1cm；V 反总：反应总体积，0.2mL；V 样：反应中样本体积，0.01mL；V 样总：加入提取液体积，1mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；W，样本质量，g；T：反应时间，3min

b. 用 96 孔板测定的计算公式如下

1．按照蛋白浓度计算

酶活性定义：每毫克蛋白每分钟氧化 1nmol 乙醇酸所需的酶量为一个酶活力单位。

GOX 活性（nmol/min /mg prot）=dA×∆ε×V 反总÷（V 样×Cpr）÷T= 784×△A÷Cpr

2．按照样本质量计算

酶活性定义：每克组织每分钟氧化 1nmol 乙醇酸所需的酶量为一个酶活力单位。

GOX 活性（nmol/min /g 鲜重）=dA×∆ε×V 反总÷（V 样×W÷V 样总）÷T= 784×△A÷Wε：乙醛酸苯腙毫摩尔消光系数：17L/mmol/cm；d：比色皿光径，0.5cm；V 反总：反应总体积，0.2mL；V 样：反应中样本体积，0.01mL；V 样总：加入提取液体积，1mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；W，样本质量，g；T：反应时间，3min