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二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(Rubisco)测试盒 BES-BK2244B

二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(Rubisco)测试盒

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二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(Rubisco)测试盒

正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定

测定意义:

二磷酸核酮糖羧化酶(EC 4.1.1.39)是植物光合作用中的一个关键酶,既控制着CO2的固定,同时又制约着碳素向Calvin循环和光呼吸循环分流,其活性的大小直接影响着光合速率。

 测定原理:

在 Rubisco 的催化下,1 分子的核酮糖-1,5-二磷酸(RuBP)与 1 分子的 CO2结合,产生 2分子的 3-磷酸甘油酸(PGA),PGA 可通过外加的 3-磷酸甘油酸激酶和甘油醛-3-磷酸脱氢酶的作用,产生甘油醛-3-磷酸,并使还原型辅酶 I(NADH)氧化。因此,340nm 吸光度的变化可计算还原型辅酶 I 氧化速率,还原型辅酶 I 氧化速率可反应 Rubisco 的活性。

 需自备的仪器和用品:

分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研钵、冰和蒸馏水。 试剂的组成和配制:

提取液一:液体 100mL×1 瓶,4℃保存。

提取液二:液体 100mL×1 瓶,4℃保存。

试剂一:25mL×1 瓶,4℃保存;

试剂二:粉剂×1 瓶,-20℃保存;临用前加入 10mL 试剂一,充分混匀待用;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融;

试剂三:粉剂×1 瓶,-20℃保存;临用前加入 10mL 试剂一,充分混匀待用;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融;

试剂四:粉剂×1 瓶,-20℃保存;临用前加入 1 mL 试剂一,充分溶解待用;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融;

(注意:试剂二、三、四溶解后,按需分装-20℃保存。)

粗酶液制备:

①总 Rubisco 酶提取:建议称取约 0.1g 样本,加入 1mL 提取液一,冰浴匀浆后超声破碎(冰浴,200W,破碎 3s,间歇 7s,总时间 1min),然后 4℃,8000g 离心 10min,取上清测定。

②胞浆和叶绿体 Rubisco 酶的分离:按照植物组织质量(g):提取液体积(mL)为 1:5~10的比例(建议称取约 0.1g 样本,加入 1mL 提取液一),冰浴匀浆后于 4℃,200g 离心 5min,弃沉淀,取上清在 4℃,8000g 离心 10min,取上清用于测定胞浆 Rubisco 酶活性,取沉淀加 1mL 提取液二,震荡溶解后超声破碎(冰浴,200W,破碎 3s,间歇 7s,总时间 1min),然后 4℃,8000g 离心 10min,取上清测定叶绿体中 Rubisco 酶活性。

建议测定总 Rubisco 酶活性,按照步骤①提取粗酶液,若需要分别测定胞浆和叶绿体中的Rubisco,则按照步骤②提取粗酶液。

(注意:粗酶液制备过程中超声破碎操作使用细胞破碎仪进行。)

测定步骤:

1、 分光光度计或酶标仪预热 30min 以上,调节波长至 340nm,蒸馏水调零。

2、 样本测定

(1) 工作液的配制:临用前将试剂二和试剂三 1:1 混合,用多少配多少;

(2) 在微量石英比色皿或 96 孔板中加入 10uL 样本、10uL 试剂四和 180uL 工作液,混匀,立即记录 340nm 处 20s 时吸光值 A1 和 5min20s 时的吸光值 A2,计算ΔA=A1-A2。

Rubisco 活性计算:

a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下:

1、按样本蛋白浓度计算

单位的定义:25℃中 1 mg 蛋白 1 min 氧化 1 nmol NADH。

Rubisco(nmol/min /mg prot)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(V 样×Cpr) ÷T =643×ΔA÷Cpr

此法需要测定粗酶液中蛋白质浓度,建议选购本公司生产的 BCA 蛋白质浓度测定试剂盒。

2、按样本鲜重计算

单位的定义:25℃中 1 g 组织 1 min 氧化 1nmol NADH。

Rubisco(nmol/min/g 鲜重)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(W× V 样÷V 样总) ÷T=643×ΔA÷W

上述计算公式中各符合含义:V 反总:反应体系总体积,2×10-4 L;ε:NADH 摩尔消光系数,6.22×103 L / mol /cm;d:比色皿光径,1cm;V 样:加入样本体积,0.01 mL;V 样总:加入提取液体积,1 mL;T:反应时间,5min;W:样本质量,g。

b.使用 96 孔板测定的计算公式如下:

1、按样本蛋白浓度计算

单位的定义:25℃中 1 mg 蛋白 1 min 氧化 1 nmol NADH。

Rubisco(nmol/min /mg prot)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(V 样×Cpr) ÷T =1286×ΔA÷Cpr

此法需要测定粗酶液中蛋白质浓度,建议选购本公司生产的 BCA 蛋白质浓度测定试剂盒。

2、按样本鲜重计算

单位的定义:25℃中 1 g 组织 1 min 氧化 1nmol NADH。

Rubisco(nmol/min/g 鲜重)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(W× V 样÷V 样总) ÷T=1286×ΔA÷W

上述计算公式中各符合含义:V 反总:反应体系总体积,2×10-4 L;ε:NADH 摩尔消光系数,6.22×103 L / mol /cm;d:96孔板光径,0.5cm;V 样:加入样本体积,0.01mL;V 样总:加入提取液体积,1 mL;T:反应时间,5 min;W:样本质量,g。


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