外泌体提取和 DNA 分离试剂盒 （细胞培养上清或尿液） 

保存与应用 

【保存条件】 

本试剂盒低温下运输，室温或 2-8℃下保存至少 12 个月（按照试剂盒不同成分 分别保存），使用前请详细阅读说明书。

【应用范围】

本产品只用于科学研究，不能用于临床诊断。

产品介绍

外泌体(Exosome)是由不同细胞分泌的直径 30-200nm 的胞外膜性囊泡 (extrocellular visicles,EVs）。外泌体普遍存在于多种体液中，其内容物丰富，包括 蛋白质、脂质、核酸等，在细胞间信息交流中发挥着重要作用，主要参与免疫抗 原呈递，神经递质传递，脂类代谢，及细胞信号转导等过程，并与多种疾病的发 生、发展、治疗及预后密切相关。
近年来，液体活检作为一种新的非侵入式主要检测血液中循环肿瘤细胞 （Circulating Tumor Cell，CTC）和循环肿瘤 DNA(Circulating Tumor DNA,ctDNA)，获取患者肿瘤病变信息，用以帮助诊断治疗，同时研究表明，在 外泌体中已检测到基因组 DNA 和线粒体 DNA (Thakur BK et al.2014;Akiko Takahashi et al.2017; Kalhert et al.2014)，为了帮助研究人员对外泌体 DNA 的研究 和应用，我们开发了外泌体提取和 DNA 分离试剂盒，可方便、快捷分离血清或 血浆中不含有其它 DNA 污染的外泌体 DNA。 外泌体提取和 DNA 分离试剂盒（Exosome Extraction & DNA Isolation Kit）适用 于从细胞培养上清或尿液中分离得到的外泌体，首先利用专门设计和表面修饰的 树脂来捕获（浓缩）样本中的外泌体，根据外泌体的结构特点，树脂可快速有效 地与外泌体结合，进而分离（浓缩）样本中外泌体，然后采用优化的裂解液释放 分离的外泌体中 DNA，采用吸附柱（Spin Columns）法可方便、快捷地纯化、 洗脱外泌体 DNA，可直接用于下游应用，如 real time PCR，expression array assays， NGS 等。

试剂盒组成和说明

使用前先在每瓶洗涤液 A (Wash Solution A)中加入 45ml 无水乙醇，混匀，并在瓶标签上 标记“√”，每次使用后立即盖紧瓶盖。 **DNaseⅠ酶置于-20℃环境下保存。
【注意事项】
1. 结合树脂彻底混匀后快速吸取。
2. 各产品组分根据要求在合适的温度下保存，自购买之日起有效期至少一年试剂盒在使用前先恢复室温，裂解液 D 在使用前检查是否有盐沉淀，建议在 使用前 37℃水浴 10 分钟，混合均匀，无沉淀，溶液清澈。
3. 本试剂盒只适用于细胞培养上清或尿液样本。
4. 本试剂盒每个反应是基于 10ml 细胞培养上清或尿液作为起始体积，样本不足 时，需要用水或 PBS 补充至 10ml。
5. 本试剂盒所有离心均在室温下进行。
6. 需要自备试剂：预冷的无水乙醇。
操作方法

一、外泌体提取
1. 样本预处理

对于冻存细胞培养上清或尿液样品，室温或 25℃水浴解冻，将完全融化的 样品置于冰上；对于新鲜的细胞培养上清或尿液样品，收集样品后置于冰上， 3,000×g，4℃离心 15min，去除细胞或细胞碎片，离心后将上清吸入新管中。

2. 外泌体结合

吸取 10ml 上述处理的细胞培养上清或尿液于 15ml 离心管中（试剂盒不提 供），加入 1.0ml 的结合缓冲液 C，盖紧盖子，颠倒混匀。

3. 外泌体浓缩

吸取 400μl 结合树脂 C（吸取前彻底混匀结合树脂，快速吸取）加入步骤 2 的 15ml 离心管中，盖紧盖子，室温颠倒混匀 15min 后，1,500×g 室温离心 2min。 轻轻将离心管从离心机中取出，用移液器取 400μl 上清液（不要弃掉），小心倒 掉剩余上清液，用移液器中的液体（400μl）轻轻吹起树脂，全部转移至纯化柱 中（已放入收集管），静置 2min，2,000×g 室温离心 2min，弃去滤液，将纯化柱 放回收集管中。

4. 外泌体洗涤

取 500μl 洗涤液 C 加到纯化柱中（已放入收集管），静置 3min，3,000×g 室 温离心 2min，弃去滤液，重复洗涤一次。

5. 外泌体洗脱

将纯化柱转移至低吸附蛋白的 2.0ml 离心管中（试剂盒提供），加入 400μl洗脱液 C，静置 5min，300×g 室温离心 2min，将滤液重新加入纯化柱，静置 2min， 最后 3,000×g 离心 2min。离心收集的溶液加入 20μl DNaseⅠ酶，混匀，37℃孵 育 15min，恢复室温。
二、外泌体 DNA 分离
1. 外泌体 DNA 释放
向上述溶液中加入 20μl 蛋白酶 K 溶液，混匀，56℃孵育 10min，简短离心， 离去管壁液体，恢复室温。加入 400μl 裂解液 D，涡旋振荡 15sec，室温放置 5min。 加入 800μl 预冷的无水乙醇，充分颠倒混匀（此时可能产生白色絮状沉淀）后室 温放置 5min。
注意：裂解液 D 在使用前应恢复室温，为了提高提取效率建议裂解液 D 使用前 37℃水浴 10 分钟后使用。
2. 外泌体 DNA 结合
将上一步所得溶液和沉淀分 3 次加入吸附柱中（已放入收集管中，每次上柱 体积不得大于 700μl)，室温静置 2min，8,000×g 离心 30sec，倒掉收集管中的滤 液，将吸附柱放入收集管中
3. 外泌体 DNA 洗涤 向吸附柱加入 500μl 洗涤液 A（请检查是否已加入指定量的无水乙醇），室 温静置 2min，8,000×g 离心 30sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管 中，重复洗涤 1 次。将吸附柱放入收集管中 12,000×g 再离心 2min，去除残液。 打开吸附柱盖子，于室温放置 5-10min，以彻底晾干吸附材料中残余的洗涤液。 注意：这一步的目的是将吸附柱中的残余的洗涤液去除，洗涤液中的乙醇的残留会影响后 续的酶反应（酶切、PCR 等）实验。
4. 外泌体 DNA 洗脱
将吸附柱转入新的 1.5ml 离心管中（试剂盒提供），向吸附柱中间位置悬空 滴加 50-200μl 洗脱液 A，室温放置 2min，12,000×g 离心 2min，离心得到的溶液 再加入吸附柱中，室温放置 2min，12,000×g 离心 2min，最后离心管中液体为提 取的外泌体 DNA，可直接应用于下游实验或保存在-20℃。 注意：洗脱液体积不应小于 50μl，体积过小会影响回收效率。洗脱液的 pH 对于洗脱效率 有很大影响，若用水做洗脱液应保证 pH 值在 7.0-8.5 范围内，pH 值低于 7.0 会降低洗脱效 率。

用途：该产品仅供科研实验使用，未经允许不得用于其它用途！以实际收货产品说明书为准，网站说明书仅供参考。