外泌体提取和DNA分离试剂盒(血清或血浆)
保存与应用
【保存条件】
本试剂盒低温下运输,室温或 2-8℃下保存至少一年(按照试剂盒不同成分分别 保存),使用前请详细阅读说明书。
【应用范围】
本产品只用于科学研究,不能用于临床诊断。
产品介绍
外泌体(Exosome)是由不同细胞分泌的直径 30-200nm 的胞外膜性囊泡 (Extracellular vesicles,EVs)。外泌体普遍存在于多种体液中,其内容物丰富, 包括蛋白质、脂质和核酸等,在细胞间信息交流中发挥着重要作用,主要参与免 疫抗原呈递,神经递质传递,脂类代谢及细胞信号转导等过程,并与多种疾病的 发生、发展、治疗及预后密切相关。
近年来,液体活检作为一种新的非侵入式主要检测血液中循环肿瘤细胞 (Circulating Tumor Cell,CTC)和循环肿瘤 DNA(Circulating Tumor DNA, ctDNA),获取患者肿瘤病变信息,用以辅助诊断、治疗,同时研究表明,在外 泌体中已检测到基因组 DNA 和线粒体 DNA (Thakur BK et al.2014;Akiko Takahashi et al.2017; Kalhert et al.2014),为了帮助研究人员对外泌体 DNA 的研 究和应用,我们开发了外泌体提取和 DNA 分离试剂盒,可方便、快捷分离血清 或血浆中不含有其它 DNA 污染的外泌体 DNA。
外泌体提取和 DNA 分离试剂盒(Exosome Extraction & DNA Isolation Kit) 适用于从细胞培养上清或体液(血清/血浆等)中分离得到的外泌体,其主要原 理是依据外泌体的膜结构特点(脂质双分子层),设计和修饰特异结合外泌体的 树脂,通过与外泌体脂质双分子层组成成分结合,而几乎不与样本中其它蛋白质 结合来实现外泌体的提取和纯化,然后采用优化的裂解液释放分离的外泌体中 DNA,采用吸附柱(Spin Columns)法可方便、快捷地纯化、洗脱外泌体 DNA, 可直接用于下游应用,如 real time PCR,expression array assays,NGS 等。
试剂盒组成和说明
使用前先在每瓶洗涤液 A (Wash Solution A)中加入 45ml 无水乙醇,混匀,并在瓶标签上 标记“√”,每次使用后立即盖紧瓶盖。 **DNaseⅠ酶置于-20℃环境下保存。
【注意事项】
1. 各产品组分根据要求在合适的温度下保存,自购买之日起有效期至少一年。 试剂盒在使用前先恢复室温,裂解液 D 在使用前检查是否有盐沉淀,建议在 使用前 37℃水浴 10 分钟,混合均匀,无沉淀,溶液清澈。
2. 本试剂盒只适用于血清或血浆样本。
3. 本试剂盒每个反应是基于 0.5ml 血清或血浆作为起始体积,样本不足时,需要 用无核酸酶水补充至 0.5ml,但样本量不要低于 200μl。
4. 本试剂盒所有离心均在室温下进行。
5. 需要自备试剂:预冷的无水乙醇。
操作方法
一、外泌体提取
1. 样本预处理
对于冻存血清或血浆样品,室温或 25℃水浴解冻,将完全融化的样品置于 冰上;对于新鲜的血清或血浆样品,收集后置于冰上,12,000×g,4℃离心 15min, 去除细胞或细胞碎片,离心后将上清吸入新管中。
2. 纯化柱平衡
吸取 500μl 平衡缓冲液加入纯化柱中(已放入收集管中),500×g 离心 2min, 弃去滤液,纯化柱重新放入收集管中,待用。
3. 外泌体结合
吸取 500μl 处理的血清或血浆放入 5.0ml 离心管中(试剂盒不提供),加入 结合缓冲液 1.5ml,颠倒混匀后室温静置 5-10min,然后将混合液分 3 次(每次 大约 700μl)加入已平衡的纯化柱中(已放入收集管中),500×g 离心 2min,每 次倒掉滤液。
4. 外泌体洗涤
吸取 0.5ml 洗涤缓冲液加入纯化柱中(已放入收集管中),500×g 离心 2min, 然后再 1,500×g 离心 4min,弃去滤液和收集管。
5. 外泌体洗脱及去除游离 DNA
将纯化柱放入新的 1.5ml 离心管中(试剂盒不提供),吸取 0.2ml 洗脱缓冲 液加入纯化柱中,500×g 离心 2min,离心得到的溶液再加入此纯化柱中,500×g 离心 2min,离心收集的溶液加入 10μl DNaseⅠ酶,37℃孵育 15min,恢复室温。
二、外泌体 DNA 分离
向上述溶液中加入 10μl 蛋白酶 K 溶液,混匀,56℃孵育 10min,简短离心, 离去管壁液体,恢复室温。加入 200μl 裂解液 D,涡旋振荡 15sec,室温放置 5min。 加入 400μl 预冷的无水乙醇,充分颠倒混匀(此时可能产生白色絮状沉淀)后室 温放置 5min。
注意:裂解液 D 在使用前应恢复室温,为了提高提取效率建议裂解液 D 使用前 37℃水浴 10 分钟后使用。
2. 外泌体 DNA 结合
将上一步所得溶液和沉淀分两次加入吸附柱中(吸附柱放入收集管中,每次 上柱体积不得大于 700μl),室温静置 2min,8,000×g 离心 30sec,倒掉收集管中 的滤液,将吸附柱放入收集管中。
3. 外泌体 DNA 洗涤
向吸附柱加入 500μl 洗涤液 A(请检查是否已加入指定量的无水乙醇),室 温静置 2min,8,000×g 离心 30sec,倒掉收集管中的废液,将吸附柱放入收集管 中,重复洗涤 1 次。将吸附柱放入收集管中,12,000×g 再离心 2min,去除残液。 打开吸附柱盖子,于室温放置 5-10min,以彻底晾干吸附材料中残余的洗涤液。
注意:这一步的目的是将吸附柱中的残余的洗涤液去除,洗涤液中的乙醇的残留会影响后 续的酶反应(酶切、PCR 等)实验
4. 外泌体 DNA 洗脱
将吸附柱转入新的 1.5ml 离心管中(试剂盒提供),向吸附柱中间位置悬空 滴加 50-200μl 洗脱液 A,室温放置 2min,12,000×g 离心 2min,离心得到的溶液 再加入吸附柱中,室温放置 2min,12,000×g 离心 2min,最后离心管中液体为提 取的外泌体 DNA,可直接应用于下游实验或保存在-20℃。
注意:洗脱液体积不应小于 50μl,体积过小会影响回收效率。洗脱液的 pH 对于洗脱效率 有很大影响,若用水做洗脱液应保证 pH 值在 7.0-8.5 范围内,pH 值低于 7.0 会降低洗脱效 率。
用途:该产品仅供科研实验使用,未经允许不得用于其它用途!以实际收货产品说明书为准,网站说明书仅供参考。