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糖原磷酸化酶b(GPb)试剂盒 BES-BK2221B

糖原磷酸化酶b(GPb)试剂盒

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糖原磷酸化酶b(GPb)试剂盒

正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定

测定意义:

糖原磷酸化酶(Glycogen phosphorylase,GP,EC 2.4.1.1))是糖原分解代谢的关键酶,使糖原分子从非还原端逐个断开 α-1,4-糖苷键移去葡萄糖基,释放 1-磷酸葡萄糖,直至临近糖原分子 α-1,6-糖苷键分支点前 4 个葡萄糖基处。GP 分为有活性的糖原磷酸化酶 a(GPa)和无活性的糖原磷酸化酶 b(GPb)两种形式。GPb 在一定浓度的腺苷酸(5,-AMP)存在下可被激活。

测定原理:

GP 催化糖原和无机磷产生葡萄糖残基生成糖原和 1-磷酸葡萄糖,磷酸葡萄糖变位酶和 6-磷酸葡萄糖脱氢酶进一步依次催化 NADP 还原生成 NADPH,在 340nm 下测定 NADPH 上升速率,即可反映 GP 活性。添加一定浓度的腺苷酸(5,-AMP)时测定 GP(GPa 和 GPb)活性,未添加腺苷酸(5,

-AMP)时测定 GPa 活性,GP 活性-GPa 活性得到 GPb 活性。

需自备的仪器和用品:

紫外分光光度计、台式离心机、可调式移液器、1mL 石英比色皿、研钵、冰和蒸馏水。

试剂的组成和配制:

提取液:60mL×1 瓶,4℃保存;

试剂一:液体 40 mL×1 瓶, 4℃保存;

试剂二:粉剂×1 瓶,-20℃保存;

试剂三:粉剂×1 支,-20℃保存;

试剂四:粉剂×1 支, -20℃保存;

试剂五:粉剂×1 支, -20℃保存;

样本的前处理:

按照组织质量(g):提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议称取约 0.1g 组织,加入 1mL提取液),进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。

测定步骤:

1、 分光光度计预热 30min 以上,调节波长至 340nm,蒸馏水调零;

2、 工作液的配制:临用前将试剂二转移到试剂一中混合溶解待用;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融。

3、 试剂三的配制:临用前在试剂三瓶中加入 2.5mL 蒸馏水充分溶解待用;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融。

4、 试剂四的配制:临用前在试剂四瓶中加入 2.5mL 蒸馏水充分溶解待用;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融。

5、 试剂五的配制:临用前在试剂五管中加入 1.25mL 蒸馏水充分溶解待用;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融。

6、 将工作液、试剂三、试剂四和试剂五置于 37℃预热 5 分钟;

7、 1mL 石英比色皿中加入 50μL 样本、50μL 试剂三、50μL 试剂四、50μL 蒸馏水和 800μL工作液,立即混匀,记录 340nm 处 5min 后的 A1 和 10min 后的吸光值 A2,计算ΔAGPa=A2-A1。

8、 在 1mL 石英比色皿中加入 50μL 样本、50μL 试剂三、50μL 试剂四、50μL 试剂五和 800μL

工作液,立即混匀,记录 340nm 处 5min 后的 A3 和 10min 后的吸光值 A4,计算ΔAGP=A4-A3。

注意:由于每个样本需要同时测一个 GP(GPa 和 GPb)活性和一个 GPa 活性,因此本试剂盒 50 管测 24 个样本。

GPb 活性计算:

(1)按样本蛋白浓度计算

单位定义:每 mg 组织蛋白每分钟产生 1nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。

GPb ( nmol/min/mg prot ) = [(ΔAGP - ΔAGPa)×V 反 总 ÷ ( ε×d ) ×109]÷(V 样 ×Cpr)÷T=643×(ΔAGP-ΔAGPa)÷Cpr

(2)按样本鲜重计算

单位定义:每 g 组织每分钟产生 1nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。

GPb(nmol/min/g 鲜重)=[(ΔAGP-ΔAGPa)×V 反总÷(ε×d)×109]÷(W ×V 样÷V 样总)÷T=643×(ΔAGP-ΔAGPa)÷WV 反总:反应体系总体积,1×10-3

L;ε:NADPH 摩尔消光系数,6.22×103L / mol /cm;d:比色皿光径,1cm;V 样:加入样本体积,0.05 mL;V 样总:加入提取液体积,1 mL;T:反应时间,5 min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g。


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