组织细胞丙二醛（MDA）检测试剂盒

产品说明：

组织细胞丙二醛（MDA）检测试剂盒是一种灵敏简单的检测脂质过氧化产物丙二醛的试剂盒。丙二醛（Malondialdehyde, MDA）是一种生物体脂质氧化的天然产物，一些脂肪酸氧化后逐渐分解为一系列包括MDA在内的复杂化合物，通过检测MDA的水平可评价脂质氧化的水平，因此MDA的测定被广泛用作脂质氧化的指标。

本试剂盒是一种基于MDA和硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid, TBA）在较高温度和酸性环境中反应生成红色MDA-TBA加和物，MDA-TBA加和物在535nm波长具有最大吸收，据此可以通过比色法进行检测。另外MDA-TBA受535nm波长激发光激发，在553nm波长发出荧光，因此，可以通过荧光法检测MDA浓度。荧光法相对比色法灵敏度提高一个数量级。

反应示意图如下：

试剂盒以比色法检测线性范围为1.56-50μM，灵敏度≤1.56μM；荧光法检测线性范围为0.156-5μM，灵敏度≤0.156μM

适用：本试剂盒能够检测动物组织、培养细胞等样本中MDA含量。

组成：

储存条件：

-20℃储存，一年有效。TBA配制成溶液后，可4℃避光储存一周。SDS溶液使用前，请恢复至室温并彻底溶解后使用，首次使用后4℃储存即可。

需要而未提供的试剂及器材

1. 超纯水

2. 0.1M PBS(PH7.0-7.4)和EDTA

3. 系列可调节量程移液器及吸头

4. 干净的试管、离心管及96孔板

5. 酶标仪

操作步骤：

1. 样品的准备

1.1 细胞样品的准备：收集约2×106～2×107个新鲜细胞，PBS洗涤细胞一次，离心收集细胞，吸尽上清加入300 μl的中等强度RIPA裂解液（提前加入100×的抗氧化剂BHT）冰浴裂解30分钟。4℃，10000g离心10分钟。取上清用于MDA定量测定。不立即测定的样品可以-70℃保存。对于细胞量差别大的样本请利用BCA蛋白定量法测定细胞裂解液上清中总蛋白浓度，以校正MDA测定结果。

1.2 组织样品的准备：利用含1mM EDTA的PBS灌流或漂洗组织，去除组织中的血液，然后取约10 mg组织，加入500 μl的中等强度RIPA裂解液（提前加入100×的抗氧化剂BHT），冰浴匀浆。4℃，10000g离心10分钟。取上清用于MDA定量测定。不立即测定的样品可以-70℃保存。另外请利用BCA蛋白定量法测定组织裂解液上清中总蛋白浓度，以校正MDA测定结果。

2. 试剂盒的准备

2.1 TBA溶液的配制：将本试剂盒提供的1管50 mg TBA倒入50ml离心管中，再加入7.5ml TBA配置震荡2分钟溶解TBA，然后加入17.5ml的纯水，彻底溶解TBA，可以超声助溶，即为TBA溶液，浓度为2mg/ml。

3. 标准品的准备

比色法标准品的配制：在1.5ml离心管中，加入950μl纯水，再取50μl的1 mM浓度MDA标准品加入离心管中配制50μM浓度MDA标准品；然后取另外5根1.5ml离心管，分别加入500μl纯水，再吸取500μl的 50μM浓度MDA标准品依次倍倍稀释为25、12.5、6.25、3.12、1.56μM浓度。

荧光法标准品的配制：在1.5ml离心管中，加入1ml纯水，再取5μl的1mM浓度MDA标准品加入离心管中配制5μM浓度MDA标准品；然后取另外5根1.5ml离心管，分别加入500μl纯水，再将500μl的5μM浓度MDA标准品依次倍倍稀释为2.5、1.25、0.625、0.312、0.156μM浓度。

测定方法

1. 在1.5 ml离心管中，按下表进行配制：

一般情况下,对照管每批只需做1-2支，若样本不存在溶血、脂血现象，对照管可以不做。

2. 将离心管置于95℃水浴或金属浴反应30分钟，然后冰浴冷却至室温。

3. 10000g离心10min，取200 μl上清溶液，测定吸光度（535nm）或发射的荧光强度（ex535nm-em553nm）。

数据处理

利用MDA标准品浓度为横坐标，吸光度值或发射荧光值为纵坐标制作标准曲线，并获得横纵坐标之间的函数关系式，然后利用标准曲线和各样品的吸光度值或发射荧光值计算样品的MDA浓度。细胞裂解上清和组织匀浆上清，可以计算每毫克蛋白中的MDA量MDA标曲测定结果如下图所示：

注意事项

1. 血红蛋白对测定有一定干扰，请尽量避免血浆和血清制备过程中的溶血。

2. TBA配制成溶液后不够稳定，要在4℃避光储存，一周内用完。

3. 初次使用试剂盒时，粉末试剂和小体积液体试剂请适当离心后使用。

4. 本产品仅限专业人员用于科学研究，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品。

5. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

用途：该产品仅供科研实验使用，未经允许不得用于其它用途！