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蛋白质定量试剂盒 (BCA法) BES20004PAK

Protein quantification kit (BCA method)

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蛋白质定量试剂盒 (BCA法)

产品描述:

Bicinchoninic acid (BCA )法是近来广为应用的蛋白定量方法。其原理与Lowery法蛋白定量相似,即在碱性环境下蛋白质与Cu2+络合并将Cu2+还原成Cu1+。BCA与Cu1+结合形成稳定的紫蓝色复合物,在562 nm处有高的光吸收值并与蛋白质浓度成正比,据此可测定蛋白质浓度。与Lowery法相比,BCA蛋白测定方法灵敏度高,操作简单,试剂及其形成的紫蓝色复合物稳定性俱佳,并且受干扰物质影响小。与Bradford法相比,BCA法的显著优点是不受去垢剂的影响。


组成与储存:(500次/2500次/200次/10000次)

(1) BCA Reagent 100ml,室温保存;

(2) Cu Reagent 2.5ml,室温保存;

(3) BSA standard 4mg/ml 1ml,−20ºC冻存。12个月有效。

所需设备:比色计、酶标仪或微板比色仪,最佳工作波长562nm,可在540-590nm之间。

工作溶液(Working Reagent, WR)配制:将50体积BCA Reagent与1体积Cu Reagent混合即为WR工作试剂,呈嫩绿色;室温1周内稳定。

标准蛋白溶液配制:用双蒸水、0.9%生理盐水、PBS或与待测蛋白样品匹配的缓冲液进行倍比稀释: 20µl 4000µg/ml BSA + 30 µl稀释溶液(H2O/PBS/0.9%NaCl) = 50µl (BSA=1600 µg/ml),从中取25 µl连续倍比稀释,得到BSA标准溶液1600、800、400、200、100、50、25 µg/ml,各25 µl。通常,样品蛋白浓度不会太高,也可以预先稀释待测样品,可以省略1600 µg/ml标准管而直接从800或1000 µg/ml开始,能节省标准蛋白用量。


蛋白浓度测定:

蛋白质浓度线性检测范围为10-2000 µg/ml。标准测定时,用1 cm光程玻璃或塑料比色皿,反应终体积1.1 ml,比色计测定。微板测定时,用96孔板,反应终体积225 µl,用酶标仪、微板比色仪测定。

1. 标准测定:将0.05~0.1 ml标准品或待测样本与1 ml WR工作溶液混合。微板测定:将25 µl标准品或待测样本与200 µl WR工作溶液混合。

2. 37ºC反应30min;也可25ºC室温2小时或过夜。60ºC 30 min反应可增加检测灵敏度至5-250µg/ml。

3. 将反应管冷却至室温。测定562 nm (可在540-590 nm之间)光密度(OD)值。

4. 绘制标准曲线。X轴为BSA标准蛋白浓度(mg/ml或µg/ml),Y轴为各标准管对应的OD562值。用Excel拟合曲线并计算蛋白浓度。


表1 标准测定和微板测定方案的加样量和比例



微板(microplate)测定方案

标准比色杯测定方案

标号

蛋白浓度(µg/ml)

标准或待测蛋白体积 (µl)

WR工作试剂(µl)

标准或待测蛋白体积 (ml)

WR工作试剂(ml)

1

0

25

200

0.05-0.1

1

2

25

25

200

0.05-0.1

1

3

50

25

200

0.05-0.1

1

4

100

25

200

0.05-0.1

1

5

200

25

200

0.05-0.1

1

6

400

25

200

0.05-0.1

1

7

800

25

200

0.05-0.1

1

8

1600

25

200

0.05-0.1

1

待测样品

25

200

0.05-0.1

1


注意事项

1. 37ºC 30min或25ºC室温反应2小时对测量较为便利,但严格来讲此时反应尚未达到终点,通常每10 min OD562值升高约2.3%。然而,通常在10min内可以测定30管并不会明显影响测定精度。

2. BCA法检测范围为20-2000 µg/ml。检测0.5~10 µg/ml高度稀释蛋白样品应采用Bradford法蛋白质定量试剂盒(# P1510)。60ºC 30 min反应可增加检测灵敏度至5~250µg/ml。

3. BCA法检测样品中含有脂类物质时光吸收值会偏高。样品中EDTA或葡萄糖浓度大于10 mM不能使用BCA方法,葡萄糖浓度大于10 mM时可用改良Lowry法蛋白定量试剂盒 #P1512,EDTA大于10 mM的样品可用Bradford法蛋白质定量试剂盒(# P1510)。另外,蛋白质样品经液体样品蛋白抽提试剂(#P1255)沉淀后,可彻底去除干扰BCA法、Bradford法、和Lowry法蛋白测定的物质。

4. 欲使测量能耐受下面表2所提示的最大干扰物质浓度,并保持测量精度,应在蛋白标准管中加入相应浓度的干扰物质,但会给操作带来不便。

5. 可测量吸附于固相支持物乳酶标板、琼脂糖、亲和层系凝胶上的蛋白。

6. 每次测定应该重新测定并制作标准曲线。


注意事项:该产品仅供科研实验使用,未经允许不得用于其它用途!

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