细胞核蛋白和胞浆蛋白制备试剂盒
产品描述:
用于从哺乳动物组织和培养细胞中提取核蛋白和/或胞浆蛋白,提取制备过程简便。制备的核蛋白和胞浆蛋白能保持天然活性,并且纯度高。提取的蛋白适于转录因子活性分析、凝胶阻滞实验(gel shift assay, EMSA)、免疫共沉淀、酶活性测定,也适于Western Blot实验。
组份:
试剂盒组成 | 50次制备 | 100次制备 提取 | 储存条件 |
Cytosol Extraction Buffer A (CEB-A) | 25 ml | 50 ml | 4 oC, 1 year |
Cytosol Extraction Buffer B (CEB-B) | 1.5 ml | 2×1.5 ml | 4 oC, 1 year |
Nuclear Extraction Buffer (NEB) | 5 ml | 10 ml | 4 oC, 1 year |
温馨提示:
1. 操作应在冰浴中进行,试剂需提前预冷。
2. 根据大致的细胞数,或大致估计离心后的细胞体积(Packed cell volume,PCV)来确定试剂的加入量。PCV因细胞类型不同而有所差异。细胞数、PCV
与试剂加入量之间的对应关系,参见下表:
培养皿直径 | 35 mm or或1孔六孔板 | 60 mm | 10 cm |
培养皿面积 | 10 cm2 | 30 cm2 | 75 cm2 |
细胞计数 | 5 ×105 | 1 ×106 | 5 ×106 |
相当于PCV(ml) | 5 | 10~20 | 50~100 |
加入CEB-A (ml) | 25 | 50~100 | 300~500 |
加入CEB-B (ml) | 1.2~1.5 | 3~6 | 3~6 |
加入NEB (ml) | 5~10 | 20 | 100 |
操作步骤:
1.裂解:(1) 培养细胞,PBS洗涤细胞两次,根据细胞计数,或者估计离心后的细胞体积PCV。每1 ×106个细胞加入50~100ml的CEB-A,刮下细胞转移
至预冷的1.5ml离心管;或者每体积PCV细胞加入5倍PCV体积的CEB-A (即10~20 ml PCV的细胞加50~100ml的CEB-A),剧烈振荡重悬。
裂解: (2) 组织样本,精确称重后剪成小块,PBS洗涤。通常每10 mg动物组织相当于1×106个细胞,需加入50~100ml CEB-A,参照上表按比例加入。
在冰上使用玻璃匀浆器匀浆组织,通常需要20~40次上下抽动匀浆,弃去筋膜组织。切记勿用高速电动匀浆器或超声破碎组织避免破坏细胞器结构。
2.裂解产物转移至预冷的1.5ml离心管,剧烈振荡30秒,冰浴10~15min,期间每5分钟振荡15秒。
3.可选步骤:根据步骤2裂解物体积,加入1/20体积的CEB-B,振荡10秒,冰浴1min (加入CEB-B可去除部分核膜蛋白,适于制备高纯度的核蛋白用
于EMSA凝胶阻滞实验等,但可使胞浆蛋白出现很少量的膜蛋白污染。若制备高纯度胞浆蛋白可跳过此步骤。若制备核蛋白仅用于普通的Western
Blot目的,则无须高纯度核蛋白,也可省略此步骤。
4. 胞浆蛋白组分的制备:将步骤2或步骤3的上清,12000g4oC离心5min,勿触动沉淀,将上清转移到新管,此即胞浆蛋白组分,可立即使用或
−20~−70ºC保存。
5. 胞核粗提组分的制备:取第步骤4的原离心管,12000g4oC瞬时离心,尽量吸除上清,保留沉淀。加入100μlCEB-A和5mlCEB-B,振荡10秒,
重悬沉淀,冰浴1min,
1000g5min,弃上清。再次加入100μlCEB-A和5mlCEB-B重悬沉淀冰浴1min,1000g5min,尽弃上清,保留沉淀。
6. 胞核蛋白的制备:加50~100μl预冷NEB重悬步骤5的离心沉淀,剧烈振荡15秒,冰上30min,期间每10min振荡15秒。12000g5min,上清液含核
蛋白成分,其中含有25%的甘油;可立即使用或−20~−70ºC保存。
说明:
1. 严格按照说明书操作,每106个细胞大约得到50-75μg蛋白。2. 裂解时间是重要的,过短则细胞裂解不全导致蛋白产率低,裂解时间长则导致胞浆
蛋白有核蛋白污染。3.只需对提取的胞浆蛋白定量(Braford或BCA法),核蛋白纯度高但含量低,无需定量,对于同一个制备,核蛋白与胞浆蛋白的量
于相平行。4. 上述制备的蛋白样品与2xSDS-PAGE混合即可上样电泳。5. 切记采用手动玻璃匀浆器,勿用高速电动匀浆器或超声破碎组织细胞,避免
破坏细胞器结构,导致分离的组分污染。玻璃匀浆器须配套选用间隙严紧的研杵,其特征是将研杵插入匀浆器套管后,提起研杵而套管不会脱落。
正确匀浆是先下压旋转研杵挤破组织,然后上下缓慢推拉研杵破碎细胞。组织样品制备效果不如细胞样品。