活性氧ROS检测试剂盒（绿色荧光）

产品描述：

活性氧包括超氧自由基（O2•−）、过氧化氢（H2O2）、羟基自由基（•OH）、过氧亚硝基（ONOO−）、一氧化氮（•NO）等，它们参与了细胞增殖生长、发育分化、衰老和凋亡等许多生理和病理过程。试剂盒采用 DCFH-DA (2,7-dichlorofluorescin diacetate)探针方法，是迄今最常用、最灵敏的细胞内活性氧检测探针。DCFH-DA 没有荧光，进入细胞后可以被酯酶水解为不能透过细胞膜的 DCFH（dichlorofluorescin），当活性氧存在时，DCFH 被氧化为强绿色荧光物质 DCF（dichlorofluorescein），荧光在激发波长 502 nm，发射波长 530 nm 附近有最大波峰，荧光水平与细胞内活性氧水平成正比。本试剂盒提供的活性氧检测系统本底水平低，灵敏度高，重复性好，操作简便。

适用范围：

贴壁细胞、悬浮细胞、新鲜动物组织

工作波长：

最佳激发波长 500（500  15 nm），最佳发射波长 525 (530  20 nm)。也可按照 FITC荧光检测条件检测。

组成： 

(1) 0.1 ml, 10 mM DCFH-DA，20 ºC 避光保存 一年有效

(2) 1 ml 活性氧供体，20ºC 避光保存 一年有效

所需设备：

流式细胞仪、荧光酶标仪、激光共聚焦显微镜、荧光分光光度计等

操作步骤：

一、 细胞样本：

1. 收集细胞，进行活性氧测定

1.1 细胞收集：悬浮细胞：2000rpm，离心 5min，收集沉淀，用 0.01M PBS 或无血清培养液洗涤 2次，1000rpm，离心 5min，弃上清，取细胞沉淀；贴壁细胞：吸去培养液，用 0.01M PBS 或无血清培养液反复吹打，使细胞层全部进入 PBS 或培养液中，收集细胞悬液，用 0.01M PBS 或无血清培养液洗涤 2 次，1000rpm，离心 5min，弃上清，取细胞沉淀；

1.2 加入 DCFH-DA 探针，同时设置阴性对照、阳性对照管样本管：用稀释好的 DCFH-DA 荧光探针重悬细胞沉淀，一般情况下，细胞密度要求 1*10⁶-2*10⁷/ml，推荐探针初始工作浓度为 10 µM（DCFH-DA 工作浓度可在 100 nM~20 µM 范围内，这需进行预实验确定最适浓度）。

阴性对照：不加探针，只加入 PBS 或培养基的细胞。

阳性对照：已加入 DCFH-DA 荧光探针，并加入活性氧供体的细胞悬液，推荐试剂工作浓度 20-100µM。

1.3 37 ºC 孵育细胞 30 分钟~几个小时。通常情况下，30-60 分钟即可。注意：孵育时间长短与细胞类型、刺激条件、DCFH-DA 浓度等有关。可以每隔 5min 颠倒混匀一下，使探针与样本充分接触。

1.4 1000g，离心 5min，去上清收集细胞沉淀，用 PBS 缓冲液洗涤 2 次，重悬细胞。

1.5 进行荧光检测，以荧光度数值表示结果。

2. 不收集细胞，直接将探针加入培养基测定

2.1 加入 DCFH-DA 探针，同时设置阴性对照、阳性对照管样本管：去除细胞培养基上清，加入用无血清培养液稀释好的 DCFH-DA 探针（推荐探针终浓度为10 µM），加入探针的体积以能盖住细胞为宜，通常 6 孔板单孔不少于 1ml。

阴性对照：不加探针，只加入培养基的细胞。

阳性对照：已加入 DCFH-DA 荧光探针，并加入活性氧供体的细胞，推荐试剂工作浓度 20-100 µM。

2.2 37 ºC 孵育细胞 30 分钟~几个小时。通常情况下，30-60 分钟即可。注意：孵育时间长短与细胞类型、刺激条件、DCFH-DA 浓度等有关。可以每隔 5min 颠倒混匀一下，使探针与样本充分接触。

2.3 弃去上层培养液，用无血清培养液或 0.01M PBS 反复吹打，使细胞层全部进入 PBS 或培养液中。

2.4 收集细胞悬液，用 0.01M PBS 或无血清培养液洗涤 2 次，去除未进入细胞内的探针，1000rpm，离心 5min，弃上清，收集细胞沉淀，用 PBS 缓冲液洗涤 2 次，重悬细胞。

2.5 进行荧光检测，以荧光度数值表示结果。

二、动物组织样本

1.1 细胞悬液制备：可采用单细胞悬液制备仪或传统的组织处理方法如：酶解法、研磨法等制备单细胞悬液；

1.2 加入 DCFH-DA 探针，同时设置阴性对照、阳性对照管样本管：用稀释好的 DCFH-DA 荧光探针重悬细胞沉淀，一般情况下，细胞密度要求 1*10⁶-2*10⁷/ml，推荐探针初始工作浓度为 10 µM（DCFH-DA 工作浓度可在 100 nM~20 µM 范围内，这需进行预实验确定最适浓度）。

阴性对照：不加探针，只用 0.01M PBS 重悬的细胞。

阳性对照： 已加入 DCFH-DA 荧光探针，并加入活性氧供体的细胞悬液，推荐试剂工作浓度 20-100µM。

1.3 37 ºC 孵育细胞 30 分钟~几个小时。通常情况下，30-60 分钟即可。注意：孵育时间长短与细胞类型、刺激条件、DCFH-DA 浓度等有关。可以每隔 5min 颠倒混匀一下，使探针与样本充分接触。

1.4 1000g，离心 5min，去上清收集细胞沉淀，用 PBS 缓冲液洗涤 2 次，重悬细胞

1.5 进行荧光检测，以荧光度数值表示结果。

注意事项：

1. 本试剂盒特别适用于贴壁细胞和悬浮细胞活性氧的检测。对于动物组织样本而言，应尽量选择新鲜组织，匀浆操作应尽量快速，以减少实验误差，如果样本已经冻存，则无法保证检测结果的可靠性。

2. DCFH-DA 可稀释于培养基或缓冲液中。血清或培养基的颜色并不会影响 DCFH-DA 及细胞内荧光的产生，但可能会影响荧光显微镜观察，干扰荧光分光光度计、荧光酶标仪或流式细胞仪的荧光测定。如果用上述仪器进行测定时，可将 DCFH-DA 稀释于无酚红培养基或适宜的缓冲液如 PBS中。

3. 加入 DCFH-DA 的时机和孵育时间，以最终能顺利检测细胞内活性氧为目的。当细胞药物处理时间较短(如<2 小时)或预计 ROS 效应较弱时，可将 DCFH-DA 在药物处理之前或者与药物同时加入到细胞培养基中；反之，当药物处理时间较长(如>6 小时)或预计产生 ROS 效应较强时，可将DCFH-DA 在药物处理之后再加入。

4. 活性氧供体内含高纯度 12 mM 的 H2O2。加入细胞后可使 DCFH-DA 氧化为 DCF 呈现强绿色荧光。推荐该试剂的细胞工作浓度为 20-100 µM 或更低浓度，当其浓度超过 200µM 时，将产生细胞毒性。如果用户熟悉 ROS 荧光或实验没有必要采用阳性对照，可以不加该试剂。一般情况下，活性氧供体加入到细胞 30min 左右即可产生明显的绿色荧光。

注意事项：该产品仅供科研实验使用，未经允许不得用于其它用途！