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Fluo-4,AM,新型钙离子荧光探针（5mM 无水DMSO溶液）
产品描述：
细胞生物学实验中常使用Fluo-3, AM作为一种荧光探针来检测细胞内钙离子浓度变化。其检测原理基于Fluo-3,AM可穿透细胞膜进入细胞，之后被细胞内的酯酶剪切形成Fluo-3，从而被滞留在细胞内。Fluo-3游离配体几乎是非荧光性的，其荧光不会随钙离子浓度升高而增强。但是，当它与细胞内钙离子结合后可以产生较强的荧光，荧光会增加60至80倍。
Fluo-4, AM是钙指示剂Fluo-3,AM的升级版本，主要变化为后者分子上的两个氯原子被Fluo-4,AM上的氟所取代，该结构上的微小变化使Fluo-4,AM加载更快，在相同浓度下检测信号更强。
本产品为Fluo-4,AM粉末状，用于细胞内钙离子检测时，Fluo-4, AM的常用浓度为0.5-5 μM。
运输与保存方法
室温（wet ice）运输。-20℃干燥避光保存，有效期至少6个月。
注意事项
1）荧光染料均存在淬灭问题，请尽量注意避光，以减缓荧光淬灭。
2）本Fluo-4,AM 容易吸潮，从冰箱取出后，请确认在干燥的环境放至室温后再开封。由于试剂极其微量，开封前请将其短暂离心，以保证粉末落入管底。
3）第一次使用时，建议母液即配即用。试剂溶解后尽可能在短时间内使用，以保证实验效果。
4）母液遇水极易分解，如果不能一次用完，建议分装保存，例如分装成5 μl/管，用封口膜封口，并用铝箔纸包裹，放在一个密闭性能好的塑料袋中，并放入一包干燥剂，在≤-20℃密封避光保存。
5）建议您在正式实验前先摸索一下细胞量、钙离子荧光探针的终浓度、培养时间等，找到最佳实验条件。
6）为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
7）本产品仅作科研用途！
需要试剂准备
1. （可选）配制Pluronic F-127母液：100mg Pluronic F-127粉末中加入0.5 mL DMSO，配制成20%(w/v)的DMSO母液。溶解过程需要在40-50℃加热20-30 min。溶液室温保存，不要冷藏。如果有结晶析出，可以重新加热后溶解，不影响使用。
2. Hanks•balanced salt solution
操作方法
1）Fluo-4,AM母液的配制：向 Fluo-4, AM中加入适量DMSO，配制成1-5 mM的储存液，DMSO的加入量根据Fluo-4,AM分子量进行计算（如：若配制成1mM的母液，需向50 ug Fluo-4,AM中加入45.6 uL DMSO）。
【注】：溶解用的DMSO需要保证新鲜无水，否则将会导致 AM 体水解，使荧光染料无法进入细胞，影响实验效果。
2）Fluo-4,AM工作液的配制：利用HBSS将Fluo-4,AM稀释成1-5µM的工作液，具体稀释方法如1 mM母液配制1 mL浓度为4 µM工作液，用1 mL HBSS溶液稀释4 µL 1 mM母液即可。
【注】：
① 推荐该探针加载浓度在4-5 µM，具体的使用浓度需根据实验要求进行优化。为了避免过度加载造成细胞毒性，建议在取得有效结果的基础上尽量使用最低探针浓度。
② Fluo-4,AM工作液需现配现用，避免反复冻存。
3）（可选）如果Fluo-4进入细胞的效果不好，可向 Fluo-4, AM/DMSO 溶液中加入适量20% Pluronic F127溶液，最终稀释至其终浓度为0.04-0.05%，Pluronic F127 可以防止 Fluo-4, AM 在 HBSS中聚合并能帮助其进入细胞。
【注】：Pluronic F127可降低Fluo-4,AM的稳定性，因此只建议在配制工作液时加入，不建议将其加入储存液长期保存。
4）取出预培养的细胞，除去培养基，使用 HBSS 溶液洗涤细胞3次。
【注】：如果使用含血清的培养基，血清中的酯酶会分解 AM 体，从而降低 Fluo 4-AM 进入细胞的效果。另外含有酚红的培养基会使本底值略微偏高，所以加工作液之前需尽量去除培养基残留。
5）将 Fluo-4, AM工作液加入细胞，加入量以覆盖细胞为准。在37℃培养10-60 min，然后除去 Fluo 4-AM 工作液。
【注】：关于孵育的时间，如果首次做实验不能确定，建议先孵育30分钟，看荧光效果：如果细胞死亡较多，适当缩短时间；如果荧光强度太弱，适当延长时间。
6）用HBSS溶液洗涤细胞 3 次，以充分去除残留的 Fluo 4-AM 工作液。然后加入 HBSS 溶液覆盖细胞。
7）37℃培养箱孵育约 20-30 分钟，以确保 AM 体在细胞内的完全去酯化作用。
8）用激光共聚焦或荧光显微镜检测细胞，激发波长 494 nm，发射波长 516 nm。