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Fluo-3,AM,新型钙离子荧光探针（5mM 无水DMSO溶液）
产品描述：
Fluo-3, AM是一种常用的检测细胞内钙离子浓度的荧光探针。它穿透细胞膜进入细胞后被细胞内的酯酶剪切形成Fluo-3，从而被滞留在细胞内。Fluo-3游离配体几乎是非荧光性的，其荧光不会随钙离子浓度升高而增强。但是，当它与细胞内钙离子结合后可以产生较强的荧光，荧光会增加60至80倍，最大激发波长为 506nm，最大发射波长为 526nm。实际检测时推荐使用的激发波长为488nm左右，发射波长为 525～530nm。可以使用激光共聚焦显微镜或流式细胞仪检测细胞内钙离子浓度的变化。
试剂准备
1）配制Pluronic F-127母液：100mgPluronic F-127粉末中加入0.5mL DMSO，配制成20%(w/v)的DMSO母液。溶解过程需要在40-50℃加热20-30min。溶液室温保存，不要冷藏。如果有结晶析出，可以重新加热后溶解，不影响使用。
2）Hanks•balanced salt solution
操作方法
1）Fluo-3,AM储存液的配制
利用高质量无水DMSO溶解Fluo-3,AM配制成2-5mM的储存液，该储存液可分装于-20℃避光干燥密封保存。每次使用前需回温至室温。
注：
① 因为Fluo-3,AM在水中的溶解性和稳定性较差，不可用水溶性缓冲液配制Fluo-3,AM储存液。
② 溶解用的DMSO需要保证新鲜无水，否则将会导致AM 体水解，使荧光染料无法进入细胞，影响实验效果。
2）Fluo-3,AM工作液的配制
利用HBSS将Fluo-3,AM稀释成1-5µM的工作液，具体稀释方法如1 mM母液配制1 mL浓度为4 µM工作液，用1 mL HBSS溶液稀释4 µL 1mM母液即可。
注：
① 推荐该探针加载浓度在4-5µM，具体的使用浓度需根据实验要求进行优化。为了避免过度加载造成细胞毒性，建议在取得有效结果的基础上尽量使用最低探针浓度。
② Fluo-3,AM工作液需现配现用，避免反复冻存。
3）（可选）如果Fluo-3进入细胞的效果不好，可向 Fluo-3, AM/DMSO 溶液中加入适量20% Pluronic F-127溶液，最终稀释至其终浓度为0.02-0.05%，Pluronic F-127 可以防止 Fluo-3, AM 在 HBSS中聚合并能帮助其进入细胞。
注：Pluronic F-127可降低Fluo-3,AM的稳定性，因此只建议在配制工作液时加入，不建议将其加入储存液长期保存。
4）取出预培养的细胞，除去培养基，使用 HBSS 溶液洗涤细胞 3次。
注：如果使用含血清的培养基，血清中的酯酶会分解 AM 基团，从而降低 Fluo 3-AM 进入细胞的效果。另外含有酚红的培养基会使本底值略微偏高，所以加工作液之前需尽量去除培养基残留。
5）将Fluo-3, AM工作液加入细胞，加入量以覆盖细胞为准。在37℃培养15-60min，然后除去Fluo-3, AM工作液。
注：
① 关于孵育的时间，如果首次做实验不能确定，建议先孵育30min，看荧光效果：如果细胞死亡较多，适当缩短时间；如果荧光强度太弱，适当延长时间。
② 降低加载温度可能会减少探针AM酯运载技术造成的探针区室化。
6）用HBSS溶液洗涤细胞 3 次，以充分去除残留的 Fluo 3-AM 工作液。然后加入 HBSS 溶液覆盖细胞。
7）37℃培养箱孵育约20-30min，以确保 AM 基团在细胞内的完全去酯化作用。
注：（可选）对于含有阴离子通道蛋白的细胞，5-7步骤中可加入有机阴离子转运抑制剂probenecid（1-2.5mM）或sulfinpyrazone(0.1-0.25mM)到细胞外液以减少指示剂去酯后的渗漏。
8）激光共聚焦显微镜或流式细胞仪等进行检测。激发波长506nm，发射波长526nm。
注：标记的条件因细胞种类而异，每次实验前，请先确定最佳条件。