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PKH26红色荧光细胞膜标记试剂盒
产品描述：
PKH26荧光细胞连接试剂盒采膜标记技术，能够将带有较长脂质尾巴的⻩⾊-橙⾊荧光染料结合到细胞膜脂质区域上。染⾊⽅式依赖于细胞与膜的类型，主要⽤于细胞体外标记、体外细胞增殖研究及体内外细胞示踪研究。试剂盒提供染⾊过程所需溶剂（稀释液），该溶剂可以可以在染⾊过程中，增加染料溶解度和染⾊效率，同时维持细胞活⼒。稀释液与哺乳动物细胞等渗，不含去垢剂或有机溶剂，也不含⽣理盐⽔和缓冲盐。根据细胞类型及标记后细胞膜内在的变化，标记后的细胞表⾯会由均⼀透亮变得有点状凸起或补丁状。但在⽣理范围内，PKH26荧光不受pH的影响，每个细胞的荧光强度与染料标记位置⽆关。PKH26 荧光稳定性强，在⻩⾊-橙⾊区域（λex=551nm, λem=567nm），可⽤来标记追踪体内外多种细胞。在细胞毒性分析，荧光蛋⽩、抗体或 DNA 染料在该区域发出的紫⾊、绿⾊、红⾊和远红外等，不会与 PKH26 产⽣⼲扰。
组份：
PKH26 染料：0.1ml 稀释液：10ml
储存条件：
避光冷藏，⽤前检查结晶，如有结晶需在 37℃⽔浴溶晶。因在⼄醇中贮藏，所以要盖紧防挥发。稀释液 C：常温或冰箱保存，⽆防腐剂和抗⽣素，保持⽆菌。
所需材料：
均匀的单细胞悬液；含⾎清培养基；⽆⾎清培养基或不含 Ca2+Mg2+的PBS 液；⾎清、⽩蛋⽩或与培养基兼容的蛋⽩源；聚丙烯锥形离⼼管；温度可控的离⼼机（0-1000g）；荧光分析仪（荧光计，荧光显微镜，流式细胞仪， 荧光图象分析仪）；超净台；细胞计数仪；载玻⽚。操作注意：快速均匀的混合对标记也很重要，为获得最佳效果应采取下述措施：
1）混合时细胞悬液和⼯作染液应等量；
2）避免染太多(>5ml)或太少（<100ul）的液体。避免⽤沾⾎清的移液管加染料；
3）液体量应尽可能精确以保证细胞和染料浓度被精确复制。
4）染料和稀释液作⽤于细胞的时间尽量短，可⽤稀释液按上述步骤作⽤于细胞看其受损程度。
5）加等量⾎清终⽌反应，在终⽌染⾊反应前别离⼼稀释液中的细胞，清洗时⽤含⾎清培养基可增加清洗效果。
6）细胞应单独移⾄新试管中离⼼，清洗 3 次时不⽤稀释液⽽⽤培养基。
7）可⽤于体外⼲细胞、淋巴细胞、单核细胞、内⽪细胞等的标记较理想。
8）全细胞标记应先于单抗染⾊的标记，当 4℃单抗染⾊时细胞跟踪探针将保持稳定；如后于单抗染⾊的标记，很可能出现“盖帽”现象。
9）染⾊细胞⽤ 2%多聚甲醛固定稳定性达高。
操作步骤：
1. 一般细胞膜标记
亲脂性染料结合到细胞膜上完成标记。染⾊强度是染料浓度和细胞浓度的函数，与渗透性⽆关。因此，保证染料添加量不过量⾮常关键。过标记的细胞将会导致细胞膜完整性缺失和或降低细胞活性。
下列过程可⽤于体内体外细胞的标记，包括⼲细胞、淋巴细胞、单核细胞、内⽪细胞、神经细胞或者任何其他细胞。体内细胞的标记过程需⼀定的改进，如⾎⼩板的染⾊，或者选择性标记吞噬细胞。
下述染⾊过程中细胞浓度和染料浓度代表操作的起始浓度。该浓度被证明适⽤于多种细胞。使⽤者需通过评估染
⾊后细胞活率（如，PI 染⾊）、荧光强度、染⾊均匀度及是否对所研究细胞功能有影响等，根据实验⽬的，确定最优的染料浓度和细胞浓度。
无菌操作步骤（总体积 2ml， 1×107 细胞/ml，所有操作在 20～25℃）
1.胰酶和/或 EDTA 消化细胞形成单细胞悬液，将 2×107 个细胞于锥形离⼼管中，⽤⽆⾎清培养基洗⼀次。
注意：⾎清蛋⽩和脂质会与染料结合，降低与细胞膜结合的染料浓度。最好在⽤稀释液重悬细胞染⾊前（第四步）⽤⽆⾎清培养基或缓冲液洗细胞⼀次（第⼀步）。
2.400×g 离⼼ 5 分钟形成松散的细胞团。
注意：PKH26 染料不能直接加到离⼼沉淀中，这样会造成细胞染⾊不均⼀和细胞活⼒降低。
3.离⼼后，⼩⼼吸弃上层清液，细胞团上剩余液体<25ul。
注意：为得到可重复的实验结果，在⽤稀释液重悬时，减少残留培养基或缓冲液体积⾮常重要。
4.加⼊ 1mL 稀释液，⽤移液管轻轻吹打混匀，制备 2×细胞悬液。重悬细胞保证完全离散，别震荡，不要让细胞在稀释液中保存时间过久。
注意：⽣理盐的存在会使得染料结团并⼤幅降低染⾊效率。需确保染⾊时细胞悬浮于稀释液中，不含培养基或缓冲盐。
5.临染⾊之前，将 4μL PKH26 溶液加⼊ 1mL 稀释液中，充分混匀，配制的2×染⾊液。注意 1：为减少⼄醇对细胞活率的影响，步骤 5 加⼊的染料使得步骤6 中⼄醇最终浓度不能超过 1-2%。
6.快速将 1mL 2×细胞悬液（步骤 4）加⼊ 1mL 2×染⾊液（步骤 5）中，⽴即⽤吸管均匀快速混合样品，因为均匀的染⾊是在瞬间发⽣的。
（最终细胞浓度为 1×107/mL）。注意：由于染⾊瞬间完成，快速将细胞与染料混匀对得到明亮、均匀和可重复的标记结果⾮常重要。
为获得最佳效果应采取下述措施：
a.不要将 PKH26 染料直接加⼊含 2×细胞的稀释液 C 中。
b.将 2×细胞悬液（步骤 4）与 2×染⾊液（步骤 5）等体积混合。
c.调整 2×细胞和 2×染料的浓度避免染⾊体积太⼩（＜100μL）或太⼤（＞5mL）。
d.⽤电动移液器快速将细胞和染料混匀。⾎清移液管混匀速度太慢⽽使得染⾊不均匀。震荡和旋涡震荡混匀同样混匀较慢，染⾊均⼀性较差。
e.分配体积尽量准确，以保证样品与样品之间，实验与实验之间的可重复性。
7.混匀后的染⾊的细胞 25℃孵育的 2-5min，定时轻轻颠倒离⼼管保证在25℃充分混匀。由于染⾊速度较快，延长孵育时间对实验没有帮助。
注意：让细胞在染⾊液中停留尽量短的时间，同时保证得到理想的染⾊强度。因为稀释液缺少⽣理性盐，过长时间的暴露在稀释液中会造成某些细胞活⼒降低。如果不能确定其影响程度，可增加仅作稀释的对照组和只⽤⼄醇⽽不⽤染料染⾊的对照组。
8.加⼊等体积的⾎清（2mL）或加⼊等量⾎清或 1%BSA 中⽌染⾊反应，孵育1min 以结合多余的染料。
注意 1：⾎清（或等效的蛋⽩浓度）为最优的终⽌液。如果⽤完全培养基（含⾎清的组织培养基）替代，添加体积为 10mL。
注意 2：不要通过加稀释液或离⼼来终⽌反应。
注意 3：不要⽤⽆⾎清培养基或缓冲盐，他们会使染料产⽣聚集。染料聚集使清洗过程中⽆法洗净，使得分析过程中仍存在未标记的细胞。
9.将细胞在 20-25℃条件下 400×g 离⼼ 10 min，⼩⼼吸弃上清。⽤ 10mL 完全培养基（含⾎清的组织培养基）重悬， 将重悬液转移⾄另⼀新的⽆菌离⼼管中，20-25℃条件下400×g 离⼼5min。⽤ 10mL 完全培养基再清洗两遍以除去没结合的染料。
注意 1：将重悬液转移⾄新离⼼管中，减少了离⼼管壁残留的染料对洗涤效率的影响；
注意2：不要⽤稀释液清洗。
10.最后⼀步清洗后，⽤ 10mL 完全培养基重悬细胞评估细胞回收率，细胞活率和荧光强度。离⼼重悬细胞⾄所需活细胞浓度。
注意 1：染⾊后的细胞可以⽤中性甲醛固定，避光条件下，荧光强度⾄少3 周内保持稳定。
注意 2：染⾊荧光强度⼀般为背景的 100-1000 倍。虽然染⾊的 CV 值与细胞种类有关，但荧光分布应该尽量均匀对称。
2. 组织学：
制备和保存含 PKH 标记细胞切⽚时要冰冻切⽚和特殊的封固标本技术。
切⽚制备：
1、 切除组织后⽴即放⼊⼲冰冰冻。
2、 切⽚前-70℃保存。
3、 ⽤ OCT 复合物制作冰冻切⽚。
4、 4-5um 组织切⽚。
5、 载玻⽚室温下⼲燥 1h。
6、 封固盖玻⽚⽤ 1-2 滴氰基丙烯酸盐粘合剂酯胶。
7、 检查和拍⽚时⽤标准的滤光器如 FITC(PKH2 和 PKH67)或 TRITC（PKH26）。复染切⽚：
1、 将玻⽚浸在丙酮液 24-48h，去除盖⽚；
2、 蒸馏⽔清洗去丙酮；
3、 复染切⽚易⽤ Mayer 或 Harris 苏⽊精；
4、 封固载玻⽚⽤ AS/AP 永久性⽔合封固液（Bio/Can America, Inc.，Porland, ME）
注意事项：
●染料的⼯作液随⽤随配，不要将配好的染料贮存，影响染⾊效果。
●PKH26 染⾊过程中，不能存在叠氮化物或代谢毒性物。
●虽然贴壁细胞也可以染⾊，但为获得均匀染⾊，单细胞悬液最佳。因此⽤蛋⽩酶（trypsin/EDTA）将贴壁细胞消化成单个悬浮细胞后再染⾊效果更佳。
●染⾊前去除⾎清和脂质以提⾼染⾊效果。
●盐的存在会导致染料形成颗粒，⼲扰染⾊反应。因此加染料前细胞重新悬置很重要。染料应直接加到细胞悬液中，⽽不是加到细胞团上。
●过度的细胞标记将导致膜完整性丧失、细胞数量下降。本样品细胞和染料浓度是参照浓度适合⼤部分细胞，但最佳染料/细胞由使⽤者根据细胞类型和实验⽬的决定，另外使⽤者还要评估细胞的⽣存⼒（排碘），荧光强度，荧光峰值的变异系数，染⾊的均匀性。●染⾊浓度根据细胞种类的不同和每孔内细胞数量的多少⽽异。不同的细胞种类标记后可以⽰踪的代次或时间差异较⼤，请根据实际情况或参考⽂献进⾏检测。