细胞生物学研究中，为了更好而长期地研究细胞生物学功能，需要将良好状态的细胞保存起来，以备将来使用。

在不附加任何保护剂下直接冻存细胞时，细胞内和外环境中的水都会形成冰晶，能导致细胞内发生机械损伤、电解质升高、渗透压改变、脱水、PH 改变、蛋白变性等，能引起细胞死亡。如向培养液加入保护剂，可使冰点降低。在缓慢的冻结条件下，能使细胞内水份在冻结前透出细胞。贮存在﹣130℃以下的低温中能减少冰晶的形成。

细胞冻存时脱离生长状态而将其细胞特性保存起来，待复苏时重新进入生长分裂周期。

细胞冻存步骤

一、怎样冻存动物细胞?

一个实验室得到一个新的细胞株后，首先要把该细胞株培养扩增后冻存起来。细胞冻存首先可以在由于污染等情况丢失细胞时有备份可用，另外几乎所有细胞在培养传代的过程中发生一定程度的变异，为了保持实验结果的一致，一般细胞在培养几十代以后就不能再使用了，需要将冻存的，传代较少的细胞化冻培养再使用。

细胞冷冻过程有四个要点：细胞的收获、保护剂的使用、冷冻速率和储存环境。

(1) 细胞的收获

用来冻存的细胞一般选择在细胞约铺满 90% 的时候，这时细胞生长状态好，细胞数量也多，并且在收获细胞前 24 小时换一次培养液。收获用来冻存的细胞开始时方法和平时一样，用 100xg 离心 5 分钟收集细胞再重悬，活细胞记数。稀释或浓缩到细胞保存的最终细胞浓度的二倍(一般是 400-1000 万 细胞 /ml )，加入已经配好的等体积的培养液保护剂混合溶液中轻轻混匀，分装到冻存管，冷冻保存。

(2) 保护剂的使用

细胞冻存中， 一般使用DMSO 作为保护剂。在细胞冻存中， DMSO 使用的最终浓度一般是 5-15% ，某种具体细胞的冻存液中的DMSO浓度可以从ATCC查到。对特别敏感的细胞特别是杂交瘤细胞在冻存时使用 95% 血清和 5%DMSO 可能会好些。保护剂在使用时先用培养液或血清配成最终浓度的2倍，再与等体积的悬浮细胞的培养液混合。

(3) 细胞冻存的速率

细胞的冷冻速率最适控制在让细胞有足够的时间脱水而又不被过度脱水导致细胞损害。对大多数细胞来说，每分钟降 1 至 3 ℃是合适的。通常的操作是把细胞先在-20℃1-2个小时，再放入 -80℃冰箱过夜(如果没有-80℃冰箱，可以用干冰替代)，再转入液氮罐或低于 -130℃的冰箱长期保存。

(4) 储存环境

细胞长期保存温度是 -130 ℃或更低。液氮罐中气态层温度在 -140℃至 -180℃之间，细胞可保存在气态层或浸入液氮中，如果可能最好保存在气态层，因为这样可避免由于有液氮进入冻存管而在拿出细胞时引起爆炸(但是这样液氮罐内只能存储少量液氮，需要经常添加)。细胞也可以在-80℃冰箱保存几个月左右的时间。

二、怎样化冻动物细胞?

● 化冻过程的原则是要让冻存的细胞快速融化。

● 如果细胞储存在液氮液面下，使用者最好准备好必要的防护器具(至少要戴上护目镜，最好戴上面罩和较厚的手套)，防止进入冻存管的液氮骤然膨胀引起爆炸而造成伤害。从冰箱或液氮罐取出细胞后将冻存管放37℃水浴轻轻晃动使之化冻完全，注意不要让水浸到盖子以防污染发生。

● 由于大多防冻剂与细胞长时间接触时对细胞有毒害，所以最好尽快除去细胞冻存时加入的防冻剂。

● 防冻剂的去除方式和细胞的敏感性有关。有些细胞在某些防冻剂存在的条件下能很好的贴壁生长，可以直接将化冻的冻存细胞连同其冻存液加入预备好15-20ml

培养液的细胞培养瓶或培养皿中，轻轻混匀后放入培养箱培养过夜后换培养液。

● 对于敏感细胞要加入 10ml 培养液中， 100xg 离心 5 分，去上清后加培养液轻轻重悬细胞，加入培养器皿后在培养箱培养，第二天更换培养液。

三、细胞活力及浓度

细胞应在生长良好、致密度约为 80-90％、数目一般为 106-107 /ml，活力达 90%以上的状态下冻存。细胞活力差的细胞在冻存后的成活率很小，因此，一定要在细胞旺盛分裂时期冻存。

四、注意冷冻保护剂之品质

DMSO 应为试剂级等级，无菌且无色，可以用 0.22 微米滤膜过滤，或者直接购买无菌产品。以 5-10 ml 小体积分装，4℃避光保存，勿作多次解冻。

使用 DMSO 前，不需要进行高压灭菌，它本身就有灭菌的作用。高压灭菌反而会破坏它的分子结构，以至于降低冷冻保存效果。在常温下，DMSO 对人体有害，故在配制时最好带上手套。混匀 DMSO 要快，因为 DMSO 对细胞有毒性，混合后应尽快冻存。尤为值得

注意的是细胞中加入冻存液后，一定要混匀，防止 DMSO 沉淀。

五、提前配制冻存液

冻存液应该提前配制，置于室温备用，防止临时配制产生的热量损伤细胞。

六、实行细胞慢冻的原则

缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内不致产生大的冰晶，导致细胞损害。对于大多数细胞来说，每分钟降 1-3℃是合适的。相反，若不缓慢冷冻，造成的结晶就大，大结晶会引起细胞膜、细胞器的损伤和破裂。复苏过程应快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重结晶。

                                                                                     以上内容来自网络