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氧化型谷胱甘肽(GSSG)含量测试盒 BES-BK2729B

氧化型谷胱甘肽(GSSG)含量测试盒

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氧化型谷胱甘肽(GSSG)含量测试盒

注意:正式测定之前选择 2-3 个预期差异大的样本做预测定。

测定意义:

GSH/GSSG 是细胞内最重要的氧化还原对之一。因此,测定细胞内 GSH 和 GSSG 含量以及GSH/GSSG 比值,能够很好地反映细胞所处的氧化还原状态,也是谷胱甘肽氧化还原循环的主要指标之一。

测定原理:

利用 2-VP 法测 GSSG 含量。

自备仪器和用品:

低温离心机、水浴锅、可调节移液器、可见分光光度计/酶标仪、微量玻璃比色皿/96 孔板、和蒸馏水。

试剂组成和配置:

试剂一:液体 100mL×1 瓶,4℃保存。

试剂二:液体 600μL×1 支,4℃保存。

试剂三:液体 50mL×1 瓶,4℃保存。

试剂四:液体 2.5mL×1 瓶,4℃保存。

试剂五: 液体 15μL×1 瓶,-20℃保存。临用前加入 0.3mL 试剂三稀释,4℃保存。

试剂六:粉剂×1 瓶,4℃保存。临用前加入 20 mL 试剂三溶解,现配现用。

粗酶液提取:

1. 组织:按照组织质量(g):试剂一体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议称取约 0.1g 组织,加入 1mL 试剂一)进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min,取上清液(如上清不清澈,再离心 3min)待测。

2. 细菌、真菌:按照细胞数量(104 个):试剂一体积(mL)为 500~1000:1 的比例(建议500 万细胞加入 1mL 试剂一),冰浴超声波破碎细胞(功率 300w,超声 3 秒,间隔 7 秒,总时间 3min);8000g 4℃离心 10min,取上清液(如上清不清澈,再离心 3min)混匀待测。

3. 血清等液体:直接测定。

GSSG 含量测定:

1. 分光光度计/酶标仪预热 30min,调节波长到 412nm,蒸馏水调零。

2. 试剂三置于 25℃(一般物种)或者 37℃(哺乳动物)水浴中保温 30min。

3.取 1 mL EP 管,加入 100μ L 上清液,5 μ L 试剂二,盖紧后混匀,得混合液,置于 25℃或37℃水浴 30min;取 21μ L 混合液于 96 孔板,然后依次加入 20 μ L 试剂四、2 μ L 试剂五和140 μ L 试剂六,迅速混匀后,测定 30 s 和 150 s 光吸收 A1 和 A2,计算ΔA=A2-A1。

GSSG 含量计算公式:

a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下

1、标准条件下测定的回归方程为 y=0.0276x-0.0011;x 为标准品浓度(nmol/mL),y 为吸光值(ΔA)。

2、 按蛋白浓度计算

GSSG(nmol/mg prot)=(ΔA+0.0011)÷0.0276×V 样÷(V 样×Cpr)=36.23×(ΔA+0.0011)÷Cpr

3、按样本鲜重计算

GSSG(nmol /g 鲜重)=(ΔA+0.0011)÷0.0276×V 样÷(V 样÷V 样总×W)=36.23×(ΔA+0.0011)÷W

4、按细胞数量计算

GSSG(nmol/104 cell)=(ΔA+0.0011)÷0.0276×V 样÷(V 样÷V 样总×细胞数量)=36.23×(ΔA+0.0011)÷细胞数量

5、按照液体体积计算

GSSG(nmol/mL)=(ΔA+0.0011)÷0.0276×V 样÷V 样=36.23×(ΔA+0.0011)V 样:反应中加入样本体积,20μL;V 样总:加入提取液体积, 1mL;W:样品质量,g,Cpr:样本蛋白浓度(mg/mL)

b.使用 96 孔板测定的计算公式如下

1、标准条件下测定的回归方程为 y=0.0138x-0.0011;x 为标准品浓度(nmol/mL),y 为吸光值(ΔA)。

2、 按蛋白浓度计算

GSSG(nmol/mg prot)=(ΔA+0.0011)÷0.0138×V 样÷(V 样×Cpr)=72.46×(ΔA+0.0011)÷Cpr

3、按样本鲜重计算

GSSG(nmol /g 鲜重)=(ΔA+0.0011)÷0.0138×V 样÷(V 样÷V 样总×W)=72.46×(ΔA+0.0011)÷W

4、按细胞数量计算

GSSG(nmol/104 cell)=(ΔA+0.0011)÷0.0138×V 样÷(V 样÷V 样总×细胞数量)=72.46×(ΔA+0.0011)÷细胞数量

5、按照液体体积计算

GSSG(nmol/mL)=(ΔA+0.0011)÷0.0138×V 样÷V 样=72.46×(ΔA+0.0011)V 样:反应中加入样本体积,20μL;V 样总:加入提取液体积, 1mL;W:样品质量,g,Cpr:样本蛋白浓度(mg/mL)

注意事项:

1. 提取过程中去掉蛋白质,所以提取液不能用于测定蛋白含量。

2. 临用前配制的试剂配好后 4℃保存,2 天内使用完毕。

3. 最低检出限为 0.1μmol/L。

4. 反应温度严格来说,为保证重复性,应在 25℃下进行反应。

5. 反应时间需精确控制,否则会影响反应速率计算,产生较大误差。

6. 样品中的 GSSG 浓度尽可能低一些,否则反应速率太大,没法控制,所以稀释倍数要尽量大些。


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